吸煙對精液DNA指標(biāo)影響的研究*

武俊青 李玉艷 高爾生 戎 芬 Melbourne Frank Hovel Ming Ji Ding Ding

吸煙對男性生殖能力的影響，特別是對精液質(zhì)量的影響，近年來已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。大量研究證明煙草中一些物質(zhì)可以誘導(dǎo)染色體發(fā)生畸變〔1〕。吸煙不僅可能影響精液常規(guī)指標(biāo)，還可能導(dǎo)致精液DNA指標(biāo)以及其他指標(biāo)的改變，但目前檢測精液中DNA含量的情況僅限于小樣本的不育人群，吸煙對精液DNA含量的影響未見報(bào)道。為此，我們選擇吸煙與不吸煙者共322例，對其進(jìn)行問卷調(diào)查并收集精液標(biāo)本，分析吸煙對精液DNA指標(biāo)的影響及其影響程度。

對象與方法

1.研究對象

本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，在江蘇省常熟地區(qū)進(jìn)行，選擇既往身體健康、年齡在20～59歲的男性，排除生殖道感染及各種手術(shù)史，無高溫及有害物質(zhì)接觸史，且內(nèi)外生殖器官發(fā)育均正常，經(jīng)知情同意后納入為研究對象。共收集合格的研究對象322例，近3年有吸煙習(xí)慣，每天至少吸1支，連續(xù)吸半年及以上者為吸煙組共195例，不吸煙組127例。取其完整精液為標(biāo)本進(jìn)行分析。

2.方法

(1)問卷調(diào)查:由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員調(diào)查研究對象的一般人口學(xué)特征、生活習(xí)慣及環(huán)境、有害物質(zhì)接觸及疾病用藥史等，還重點(diǎn)調(diào)查了研究對象是否吸煙、開始吸煙年齡、吸煙年限、每日吸煙量等。

(2)精液采集及分析:要求對象取精前禁欲3～6天，在專門的取精室用手淫法留取全部精液于無菌取精杯中。室溫保持在(25±3)℃左右。細(xì)胞成熟程度與DNA含量密切相關(guān)。初級精母細(xì)胞經(jīng)兩次減數(shù)分裂所形成的精子細(xì)胞，其每條染色體僅為1條染色單體，DNA含量相當(dāng)于初級精母細(xì)胞DNA含量的1/4。采用流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)一檢測精液DNA指標(biāo)。經(jīng)加工處理可以計(jì)算出:碎片及凋亡細(xì)胞、單倍體精子、單倍體與二倍體之間的各級分化細(xì)胞、二倍體細(xì)胞及多倍體細(xì)胞的比例共5個(gè)指標(biāo)。正常精液中單倍體精子所占比例較高(＞90%)，而精液異常時(shí)單倍體精子所占比例降低，碎片細(xì)胞、二倍體及多倍體細(xì)胞的比例可能增加。由于五個(gè)指標(biāo)均為非正態(tài)分布，其和為100%，其中最為重要的是單倍體精子，因此，研究未對所有5個(gè)指標(biāo)均進(jìn)行分析，只對單倍體精子比例、二倍體細(xì)胞比例和多倍體細(xì)胞比例進(jìn)行了分析。

(3)質(zhì)量控制:本研究采用統(tǒng)一的問卷調(diào)查及精液采集和檢測方法。研究開始前集中對相關(guān)研究人員進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)，統(tǒng)一問卷的填寫標(biāo)準(zhǔn);研究過程中嚴(yán)格執(zhí)行對象的篩選條件和精液采集條件。固定專門的實(shí)驗(yàn)室技師進(jìn)行統(tǒng)一檢測。

(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用Epi-info軟件建立數(shù)據(jù)庫，雙人雙遍數(shù)據(jù)錄入并進(jìn)行校對，數(shù)據(jù)庫固定后采用SAS 9.2軟件包進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)、logistic回歸等統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

1.一般情況

吸煙和不吸煙對象的年齡、文化程度、職業(yè)、人均年收入、坐姿工作、是否使用計(jì)算機(jī)、接觸有害物質(zhì)、婚姻狀況、遺精史、是否避孕、配偶是否妊娠過等特征的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究對象的生活習(xí)慣有差異，吸煙對象飲茶、飲酒、穿緊身褲的比例均高于不吸煙的對象。吸煙者家用電器個(gè)數(shù)4個(gè)以下的比例略低于不吸煙者。吸煙對象的吸煙暴露情況見表1。

2.是否吸煙對精液DNA指標(biāo)的影響

按單倍體精子、二倍體細(xì)胞及多倍體細(xì)胞比例的四分位數(shù)(P25、P50、P75)為界值，分別將其分為四組(＜ P25組、P25～組、P50～組、P75～組)，采用降序擬合三個(gè)有序多分類logistic回歸模型，分析吸煙對各指標(biāo)分布是否有影響及其影響程度。結(jié)果顯示:吸煙可能使單倍體精子比例降低(OR=0.55，95%CI:0.37～0.83);吸煙組二倍體細(xì)胞(OR=1.99，95%CI:1.32～2.98)、多倍體細(xì)胞(OR=2.43，95%CI:1.61 ～3.66)的比例升高。調(diào)整年齡、接觸有害物質(zhì)、是否飲茶及飲酒、使用電器個(gè)數(shù)的多因素非條件logistic回歸分析結(jié)果與單因素分析的結(jié)果一致，仍然提示吸煙可能使單倍體精子比例降低(OR=0.63，95%CI:0.41～0.97)，同時(shí)可能增加二倍體細(xì)胞(OR=1.67，95%CI:1.08～2.57)和多倍體細(xì)胞(OR=1.85，95%CI:1.20～2.86)的比例，見表2。

表1 吸煙對象的暴露情況

3.吸煙相關(guān)因素對精液DNA指標(biāo)的影響

為進(jìn)一步了解吸煙對精液DNA的影響及其影響程度，對吸煙量進(jìn)行分組，擬合logistic回歸模型分析不同吸煙劑量對精液DNA各指標(biāo)分布的影響。結(jié)果顯示:與不吸煙組相比，吸煙年限20年及以上、每日吸煙量15支及以上和總吸煙量≥10萬支的對象單倍體精子趨向于更低的等級分布;而吸煙20年以下、每日吸煙支數(shù)15支以下、總吸煙量10萬支以下的對象單倍體精子的分布和不吸煙組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;對于二倍體細(xì)胞和多倍體細(xì)胞，其各劑量組與不吸煙組相比，均趨向于較高的等級分布(除每日吸煙量＜15支組的二倍體細(xì)胞外)，結(jié)果見表3。調(diào)整年齡、接觸有害物質(zhì)、是否飲茶及飲酒、電器個(gè)數(shù)的多因素非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示:單倍體精子分析結(jié)果與單因素分析的結(jié)果一致，而對于二倍體細(xì)胞和多倍體細(xì)胞，只有高劑量組趨向于更高的等級分布，而低劑量組與不吸煙組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示吸煙年限、每日吸煙量及總吸煙量，達(dá)到一定程度時(shí)，就可能影響精液中單倍體精子、二倍體細(xì)胞及多倍體細(xì)胞的比例。

表2 吸煙對精液DNA指標(biāo)影響的logistic回歸分析

表3 吸煙相關(guān)因素對精液DNA指標(biāo)影響的logistic回歸分析

討 論

影響精液質(zhì)量的因素眾多，如重金屬〔2〕、性生活方式〔3〕、吸煙〔4〕等。近年來，國內(nèi)外已經(jīng)開展了一些有關(guān)吸煙與精液質(zhì)量的研究。精液質(zhì)量常用精液量、精子密度、精子活率、精子活力及精子形態(tài)等指標(biāo)來衡量〔5〕。然而吸煙不僅可能影響精液常規(guī)指標(biāo)，使精子的數(shù)量減少和活動(dòng)率降低，畸形精子的發(fā)生率增多，還可能直接損害精子，導(dǎo)致精子DNA指標(biāo)以及其他指標(biāo)的改變;吸煙可能影響生殖細(xì)胞的成熟和增殖，是精子發(fā)生的致突變物質(zhì)〔6〕。

煙草濃聚物及其代謝產(chǎn)物中富含誘基因突變和誘癌物質(zhì)，這些物質(zhì)使調(diào)節(jié)精子生成的遺傳基因合成受阻。精子的產(chǎn)生包括精細(xì)胞數(shù)量的增多和繁殖細(xì)胞的分化成熟，全部過程均需要核糖核酸和蛋白質(zhì)合成的參與，因此該合成過程受阻，可引起精子DNA突變及畸形精子增加。動(dòng)物模型的研究結(jié)果表明:吸煙可導(dǎo)致精子微核畸變率增加。

國外以男性為研究對象，也開展了大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)室研究。結(jié)果提示:吸煙可以增加精液DNA的氧化損害，還可能影響DNA的完整性導(dǎo)致其斷裂，同時(shí)可能增加DNA的脆弱性。Horak等〔7〕募集了179名男性，其中健康志愿者86人和有生育力損害的病人93名，分析了他們精子中大的DNA片段的水平。其結(jié)果顯示:在健康志愿者中，現(xiàn)吸煙者精子中大DNA片段的水平是非吸煙者的2.7倍(P=0.008)。Arabi M〔8〕等對尼古丁與精子質(zhì)膜、DNA完整性以及精子活力的研究結(jié)果表明:尼古丁能夠誘使精子中雙鏈DNA斷裂，對于精子質(zhì)膜和DNA完整性而言，尼古丁是一種潛在的氧化因子。

國內(nèi)學(xué)者對吸煙與人類精子染色體的關(guān)系開展了研究，結(jié)果均顯示:與不吸煙者相比，吸煙可導(dǎo)致人精子單倍染色體畸變率增高。其中，張昌軍等〔9〕對37名平均年齡32歲(28～34歲)具有生育能力、無酗酒史的健康男性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):不吸煙者的染色體結(jié)構(gòu)畸變精子率為4.05%，輕度吸煙者(20支/日)的染色體結(jié)構(gòu)畸變精子率為8.31%，而重度吸煙者(40支/日)染色體結(jié)構(gòu)畸變精子率高達(dá)13.83%(P＜0.01)。

然而，也有一些研究發(fā)現(xiàn)吸煙不影響精子DNA指標(biāo)。Sergerie等〔10〕將97名健康志愿者分為不吸煙組、輕度吸煙組和重度吸煙組，比較三組的精子DNA碎片水平和鎘含量的差別。結(jié)果顯示:精子DNA碎片的比例在三組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果可能和研究樣本含量較小，或分析時(shí)沒有考慮可能的混雜因素有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)吸煙量達(dá)到一定程度時(shí)，就可能影響精液中DNA指標(biāo)。吸煙可使精液中單倍體精子的比例降低，同時(shí)使二倍體細(xì)胞以及多倍體細(xì)胞的比例升高。因此吸煙對精液質(zhì)量是有害的，盡管在一些研究中，沒有發(fā)現(xiàn)吸煙對精液常規(guī)指標(biāo)有明顯的影響，但可能已經(jīng)導(dǎo)致了精液DNA指標(biāo)以及其他指標(biāo)的改變。香煙對精液質(zhì)量的損害受多種因素的影響，而不同的精液指標(biāo)對煙草的敏感程度也是不同的。不同對象對香煙的耐受程度也可能有所不同，但當(dāng)吸煙達(dá)到一定的劑量時(shí)即會(huì)對精液質(zhì)量產(chǎn)生影響。

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9．張昌軍，劉浩，王華等．吸煙對人精子單倍染色體的影響．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2003，11(6):47-48．

10．Sergerie M，Ouhilal S，Bissonnette F，et al．Lack of association between smoking and DNA fragmentation in the spermatozoa of normal men．Hum Reprod，2000，15(6):1314-1321．