快中子與DES復(fù)合誘變選育高產(chǎn)木聚糖酶黑曲霉菌株

韓冰瑩 陳 光 王 剛 費(fèi)卓群

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

飼料原料中含有較多的木聚糖(Xylan),木聚糖在動(dòng)物體內(nèi)難以被吸收利用,使進(jìn)食動(dòng)物消化道中的食糜體積變大,黏度增加,阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。食糜在消化道中的滯留會(huì)使動(dòng)物生長(zhǎng)減慢，嚴(yán)重降低生產(chǎn)性能[1]。木聚糖酶(xylanase)是一類能夠降解木聚糖的復(fù)合酶系，以內(nèi)切的方式降解木聚糖分子中β-1，4木糖苷鍵[2]。木聚糖酶的研究對(duì)于木聚糖的利用有著重大意義,在飼料工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。國(guó)外對(duì)于木聚糖酶的研究較多,國(guó)內(nèi)的研究較少且所產(chǎn)木聚糖酶活力不高。本文通過快中子與硫酸二乙酯復(fù)合誘變黑曲霉AS3.350，篩選出一株高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉,得到最佳的誘變條件，為誘變技術(shù)應(yīng)用于微生物的品種改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

AS3.350購(gòu)自中科院微生物研究所。

1.1.2 中子源

中子源是利用高壓倍加器使離子源產(chǎn)生的氘離子加速轟擊氘靶產(chǎn)生的14Mev快中子。該設(shè)備由東北師范大學(xué)輻射技術(shù)研究所提供。

1.1.3 試劑

pH值5.0檸檬酸緩沖液、DNS試劑、pH值4.5醋酸緩沖液、pH值6.0磷酸緩沖液、D-木糖溶液、硫酸二乙酯(DES)。

1.1.4 儀器

電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司）、PB-10型數(shù)字酸度計(jì)（德國(guó)賽多利斯股份公司）、低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）、培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、722型光柵分光光度計(jì)（山東高密彩虹分析儀器有限公司）。

1.1.5 培養(yǎng)基

① PDA 培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g、KH2PO41 g、Mg－SO4·7H2O 1.5 g、馬鈴薯 200 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值自然；

② 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO426 g、CaCl25 g、Mg－SO4·7H2O 10 g、FeSO4·7H2O 0.16 g、酵母膏 10 g、麩皮20 g、Tween-80 5 ml，pH 值 5.0；

③ 剛果紅初篩培養(yǎng)基[5-6]：酵母膏10 g、麩皮20 g、KH2PO426 g、CaCl25 g、MgSO4·7H2O 10 g、FeSO4·7H2O 0.16 g、瓊脂粉 20 g、剛果紅 0.3 g，pH 值 5.0；

④ 種子培養(yǎng)基：K2HPO41 g、KCl 0.5 g、NaNO32 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖 30 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

1.2 菌種培養(yǎng)

1.2.1 菌種活化

取貯藏的黑曲霉AS3.350用PDA斜面培養(yǎng)基活化2代。

1.2.2 菌種培養(yǎng)

取活化后的2代黑曲霉AS3.350于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 ml三角瓶裝液量50 ml，搖床中28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)60 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

5%的接種量接種種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為50 ml/250 ml，28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 108 h。

1.3 菌懸液的制備

用生理鹽水將PDA斜面培養(yǎng)基中的2代黑曲霉AS3.350孢子洗脫下來，置于三角瓶中并放入玻璃珠，搖床上200 r/min振蕩1 h，用無菌紗布過濾孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子個(gè)數(shù)，用生理鹽水稀釋一定倍數(shù)，使孢子濃度保持在 107～108個(gè)/ml[7-8]。

1.4 篩選方法

1.4.1 初篩

將菌懸液涂布于剛果紅初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 h，用生理鹽水進(jìn)行脫色，挑選水解圈較大的單菌落接種于PDA培養(yǎng)基，以備復(fù)篩。

1.4.2 復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床中28℃振蕩培養(yǎng)60 h，按照一定比例加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床中28℃振蕩培養(yǎng)108 h，測(cè)木聚糖酶酶活。

1.5 誘變方法

1.5.1 快中子誘變

以劑量率為0.002 5 Gy/s,劑量為0.15、0.45、0.75、1.50、2.25、3.00、4.50 Gy 處理菌懸液，將輻照后的菌液稀釋10-2～10-6，取不同稀釋倍數(shù)的菌液各0.25 ml涂布于初篩培養(yǎng)基。

1.5.2 硫酸二乙酯（DES）誘變

取0.5 ml DES加入4.5 ml 95%乙醇中制成DES溶液，將DES溶液與菌懸液按一定體積比，比例（DES∶菌懸液）分別為：1∶ 500、1∶ 250、1∶ 200、1∶ 100、30 ℃振蕩處理 20、30、40、60 min，加入 2 ml 0.5 mol/l硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，并稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基。通過酶活力確定最佳誘變條件后，用最佳條件對(duì)快中子輻照篩選的突變株進(jìn)行復(fù)合誘變。

1.6 突變株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性

將高產(chǎn)突變株在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)6代，將每一代分別接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)108 h，離心取上清液，測(cè)木聚糖酶活力，確定突變株經(jīng)過多次傳代后保持產(chǎn)酶穩(wěn)定性。

1.7 分析方法

1.7.1 粗酶液的制備

將發(fā)酵液過濾，濾液在4℃、8 000 r/min條件下離心，上清液即粗酶液。

1.7.2 酶活力的測(cè)定

木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別在試管中加入10μmol/ml D-木糖溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml,補(bǔ)入檸檬酸緩沖液定容至1 ml,再加入3 ml DNS煮沸15 min,取出后迅速冷卻，加蒸餾水補(bǔ)至25 ml，以不加木糖溶液的0號(hào)管為對(duì)照，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。木糖含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程為：y=0.103 4x-0.045 4(R2=0.993 5)。

木聚糖酶酶活力的測(cè)定:將0.9 ml 1%木聚糖底物加入到25 ml具塞試管中，50℃水浴中保溫10 min，加入0.1 ml經(jīng)檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當(dāng)稀釋的酶液，在50℃水浴中反應(yīng)10 min，加入3 ml DNS終止反應(yīng)，并煮沸15 min，取出后迅速冷卻，補(bǔ)蒸餾水至25 ml，混勻后在540 nm波長(zhǎng)處比色。對(duì)照管中的酶液滅活后加入[8-9]。

酶活力單位定義：50℃、pH值5.0的條件下，每分鐘每毫升待測(cè)酶液分解底物釋放出1 μmol還原糖的量為一個(gè)酶活力單位（U）。

酶活力(U)=D×V1×CX/T×V2[10]。

式中：D——酶液稀釋倍數(shù)；

V1——比色管定容體積（ml）；

CX——木糖摩爾濃度（μmol/ml）；

V2——酶液體積（ml）；

T——酶解時(shí)間（min）。

相對(duì)酶活力（%）＝突變株酶活力/原始菌株酶活力×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 快中子照射

利用7個(gè)不同的輻照劑量對(duì)黑曲霉進(jìn)行誘變，通過快中子輻照菌株的致死率和正突變率可得出最佳誘變條件，見表1。

表1 快中子輻照誘變后菌株的致死率和正突變率

如表1所示,當(dāng)輻照劑量在0.15～4.50 Gy范圍內(nèi)，致死率逐漸增加，正突變率上升后下降，在輻照劑量0.75 Gy時(shí)正突變率最高，致死率達(dá)到半數(shù)，當(dāng)照射量為4.50 Gy時(shí)，快中子輻照黑曲霉的致死率接近100%，因此，0.75 Gy為最佳條件。在快中子輻照劑量為0.75 Gy的條件下，選取10株水解圈相對(duì)較大的突變株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)木聚糖酶酶活，以黑曲霉AS3.350為對(duì)照組，黑曲霉AS3.350的酶活力為100%，結(jié)果見圖1。

如圖1所示，0.75 Gy快中子誘變的突變株酶活力均有所提高，其中Fn5-2木聚糖酶酶活較原始菌株提高1.72倍，木聚糖酶酶活為134.77 U/ml。說明黑曲霉對(duì)快中子敏感，對(duì)黑曲霉進(jìn)行快中子輻照的小劑量刺激能顯著提高其產(chǎn)木聚糖酶能力，提高酶活力的變異程度。

圖1 快中子輻照突變株木聚糖酶的相對(duì)酶活

2.2 硫酸二乙酯（DES）復(fù)合誘變

利用4個(gè)不同的體積比（DES∶菌液）對(duì)黑曲霉AS3.350進(jìn)行誘變，通過致死率和正突變率得到最佳誘變條件，見表2。

表2所示，DES對(duì)黑曲霉AS3.350的致死率與DES的濃度及誘變時(shí)間成正比關(guān)系，隨著DES與菌液比例的增大及誘變時(shí)間的增加，致死率也隨之增加。在DES∶菌液為1∶250、誘變時(shí)間為20 min的條件下，正突變率最高，為40.5%，得到硫酸二乙酯誘變的最佳條件為：DES∶菌液體積比為1∶250、誘變時(shí)間為20 min。

表2 硫酸二乙酯誘變致死率和正突變率（%）

按最佳的DES誘變條件對(duì)突變株Fn5-2進(jìn)行復(fù)合誘變，選取8株水解圈大的突變株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)木聚糖酶酶活，以出發(fā)菌株AS3.350為對(duì)照組，以出發(fā)菌株酶活力為100%，結(jié)果如圖2。

圖2 硫酸二乙酯誘變突變株木聚糖酶的相對(duì)酶活

如圖2所示，突變株Fn5-2經(jīng)過DES的復(fù)合誘變酶活力有所提高，達(dá)到了157.07 U/ml，較原始菌株提高了2倍。

3 結(jié)論

利用快中子對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，并用DES對(duì)突變株進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選出一株高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌株DES20-4，木聚糖酶酶活力為157.07 U/ml，是出發(fā)菌株的2倍。

我們發(fā)現(xiàn)快中子輻照的誘變效果較其他誘變方法好，甚至超過了亞硝基胍（MNNG）這樣的強(qiáng)誘變劑，并且比MNNG操作起來更安全。高定華等做了快中子對(duì)黑曲霉產(chǎn)糖化酶的誘變效應(yīng)，正突變率為29.7%，與本次研究接近，但他們采用的劑量較大，致死率過高，我們采用了小劑量取得了良好的效果。

快中子輻照方法進(jìn)行微生物誘變育種目前很少應(yīng)用，快中子輻照相對(duì)于傳統(tǒng)誘變方式來說，快中子的能量較高，次級(jí)電離密度較大，能更直接地作用于遺傳物質(zhì)，使DNA合成延遲，細(xì)胞分裂受阻，引起基因突變和染色體變異，試驗(yàn)證明，快中子輻照是一種很好的微生物誘變育種方式，適合對(duì)微生物進(jìn)行小劑量刺激。