雙藤巴布劑中青藤堿、雷公藤甲素的體外釋放與體外透皮機(jī)制研究Δ

鄧亞利，周莉玲（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系，廣州510642；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405）

青風(fēng)藤、雷公藤抗炎抗風(fēng)濕療效確切，臨床上應(yīng)用廣泛。青風(fēng)藤有效成分主要為青藤堿；雷公藤有效成分主要為雷公藤內(nèi)酯醇（甲素）[1，2]。本研究擬通過(guò)合理組方，以青風(fēng)藤、雷公藤配成藥對(duì)，組成復(fù)方，制成復(fù)方巴布劑，對(duì)其合用后藥物釋放及其透皮行為進(jìn)行研究，并與青藤堿、雷公藤甲素單體組成的復(fù)方巴布劑進(jìn)行比較，探討外用替代口服、復(fù)方替代單方的可行性與優(yōu)越性。

筆者對(duì)2種巴布劑的體外釋藥和透皮吸收特征[3，4]進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，探討制劑中藥物的釋放機(jī)制，同時(shí)考察經(jīng)皮給藥后2種有效成分局部藥物濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律，并預(yù)期合用后其治療特點(diǎn)，為其他復(fù)方中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Summit P680型高效液相色譜儀，由PDA-100型二級(jí)管陣列檢測(cè)器、ASI-100型自動(dòng)進(jìn)樣器、Summit恒溫箱、Chromeceon色譜工作站組成（德國(guó)Dionex公司）；ZRS-4型智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)無(wú)線電廠）；TK-12A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；TGL-16型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)療器械六廠）。

1.2 試藥

雙藤巴布劑（STEP）、青藤堿雷公藤甲素巴布劑（STP）由筆者自制（均含青藤堿 2.5 mg·cm－2、雷公藤甲素 25 μg·cm－2）；青藤堿對(duì)照品（批號(hào)：0774-200105）、雷公藤甲素對(duì)照品（批號(hào)：111567-200502）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.3 動(dòng)物

4周齡BALB/C裸鼠，♂，體重（20±2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：0028166）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.005 mol·L－1磷酸氫二鈉溶液，以0.005 mol·L－1的磷酸二氫鈉調(diào)pH值至8.0，再以1%三乙胺調(diào)pH值至9.0）＝55∶45；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm。理論板數(shù)按青藤堿峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取青藤堿、雷公藤甲素對(duì)照品各適量，用甲醇配成每1 mL含青藤堿0.2352 mg、雷公藤甲素40.512 μg的對(duì)照品貯備溶液，貯藏，備用。精密吸取對(duì)照品貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，甲醇定容，得青藤堿（9.41 μg·mL－1）與雷公藤甲素（1.62 μg·mL－1）對(duì)照品溶液，將此溶液分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL；精密吸取對(duì)照品貯備溶液5 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，分別進(jìn)樣1、2、4、8、12、16、20 μL。以青藤堿、雷公藤甲素進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得青藤堿的回歸方程為Y＝0.0281X－0.0205（r＝0.9998，n＝6）與Y＝35.142X－0.1393（r＝0.9994，n＝7）。結(jié)果表明，青藤堿進(jìn)樣量在9.41～94.08 ng與0.12～2.35 μg之間與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。雷公藤甲素的回歸方程為Y＝0.0487X－0.0135（r＝0.9995，n＝6）與Y＝0.0369X+0.0356（r＝0.9999，n＝7）。結(jié)果表明，雷公藤甲素進(jìn)樣量在3.24～16.20 ng與20.26～405.12 ng之間與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液（含青藤堿0.2352 mg·mL－1、雷公藤甲素40.512 μg·mL－1）、對(duì)照品溶液（含青藤堿9.41 μg·mL－1、雷公藤甲素1.62 μg·mL－1），分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。日內(nèi)精密度（n＝6）結(jié)果：青藤堿峰面積的RSD為1.04%與1.86%，雷公藤甲素峰面積的RSD為1.22%、1.88%；日間精密度（n＝5）結(jié)果：青藤堿峰面積的的RSD為1.26%、1.93%，雷公藤甲素峰面積的RSD為1.72%、1.98%，表明該方法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，室溫條件下每隔2 h進(jìn)樣1次，8 h內(nèi)測(cè)定4次。結(jié)果，青藤堿峰面積的RSD為1.56%（n＝4），雷公藤甲素峰面積的RSD為1.97%（n＝4），表明在室溫條件下檢測(cè)成分8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率測(cè)定 精密吸取青藤堿（9.41 μg·mL－1）與雷公藤甲素（1.62 μg·mL－1）對(duì)照品溶液5.0 mL，氮?dú)獯蹈?，甲醇定容? mL，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，青藤堿的平均回收率為99.86%（RSD＝1.03%，n＝6），雷公藤甲素的平均回收率為97.56%（RSD＝1.02%，n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.6 最低檢測(cè)限測(cè)定 按信噪比（S/N）＝3作為最低檢測(cè)限，測(cè)得雷公藤甲素的最低檢測(cè)限為1.62 ng，青藤堿的最低檢測(cè)限為9.41 ng。

2.2 體外釋放度試驗(yàn)

參照2005年版《中國(guó)藥典》釋放度測(cè)定第三法進(jìn)行。釋放介質(zhì)為30%乙醇-生理鹽水。量取經(jīng)脫氣處理過(guò)的釋放介質(zhì)250 mL注入溶出杯內(nèi)，預(yù)溫至（32±0.5）℃。取經(jīng)皮給藥制劑各1片（面積為25 cm2），分別固定于兩層不銹鋼碟片的中央，釋放面朝上，再將網(wǎng)碟置于溶出杯下部，使制劑與槳底旋轉(zhuǎn)面平行，兩者相距（25±2）mm。開(kāi)始計(jì)時(shí)，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，分別于1、2、4、6、8、12、16、24 h取樣5 mL，取樣位置在介質(zhì)液面與槳葉上端之間正中，離溶出杯壁距離1 cm。每次取樣后立即補(bǔ)充相同體積的空白釋放介質(zhì)。

取上述溶出液1 mL，氮?dú)獯蹈桑状级ㄈ葜? mL，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定青藤堿、雷公藤甲素的峰面積，根據(jù)對(duì)照品的峰面積計(jì)算其濃度。按以下公式計(jì)算單位面積累積釋放量（Q，μg·cm－2）：

式中，Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度（μg·mL－1）；Ci為第i（i＝n－1）個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度（μg·mL－1）；D為制劑中青藤堿、雷公藤甲素含量（μg）。

青藤堿與雷公藤甲素的累積釋放量見(jiàn)圖1。

將STP與STEP經(jīng)皮給藥制劑的單位面積的Q分別對(duì)時(shí)間（t，h）按零級(jí)、一級(jí)與Higuchi動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行線性回歸，解釋其釋藥機(jī)制[6]。結(jié)果均以Higuchi方程擬合度較優(yōu)（STP中：r青＝0.9955，r甲＝0.9958；STEP中：r青＝0.9920，r甲＝0.9963），說(shuō)明2種制劑均屬骨架型釋藥系統(tǒng)。藥物以微細(xì)的粒子混懸分散在基質(zhì)中，每單位體積基質(zhì)所含溶解與混懸藥物總量比藥物在基質(zhì)中的飽和濃度大，藥物的釋放量與時(shí)間的平方根成正比。青藤堿、雷公藤甲素以單體入藥和以浸膏入藥，在相同基質(zhì)中的釋藥速率（J）基本相同。青藤堿、雷公藤甲素的體外釋放動(dòng)力學(xué)方程分別見(jiàn)表1、表2。

表1 青藤堿的體外釋放動(dòng)力學(xué)方程Tab 1 In vitro release kinetics equation of sinomenine

表2 雷公藤甲素的體外釋放動(dòng)力學(xué)方程Tab 2 In vitro release kinetics equation of triptolide

由表1、表2可知，2種經(jīng)皮給藥制劑的體外釋藥隨時(shí)間為一個(gè)遞增過(guò)程。青藤堿在STP、STEP中，24 h的累積釋放百分率（Q%）分別為83.52%、78.09%；J分別為468.5、455.58 μg·cm－2·h－1/2。雷公藤甲素在STP、STEP中，24 h的Q%分別為80.32%、75.26%；J分別為4.6112、4.3879 μg·cm－2·h－1/2。

2.3 體外透皮試驗(yàn)

采用透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀[5]，先將磁攪拌子放在接收池內(nèi)，再將制備的離體裸鼠背部皮膚平放在接收池上端，角質(zhì)層面向上，然后將釋放池用夾子固定于接收池上。在接收室中注入接收液7 mL，保持（32±0.2）℃恒溫水浴，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為（200±5）r·min－1，預(yù)平衡1 h。倒掉接收池中的溶液，加入空白接收液。釋放池中放上巴布劑，于預(yù)定的間隔時(shí)間（2、4、6、8、10、12、16 h）分別取樣5 mL，每次取樣后補(bǔ)加相同體積的新鮮接收液并排除接收室中的氣泡。

取上述溶出液5 mL，氮?dú)獯蹈?，甲醇定容? mL，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)對(duì)照品的峰面積計(jì)算其濃度。按以下公式計(jì)算Q

式中，Cn、Ci、D的意義同“2.2”項(xiàng)下。

以STP、STEP中青藤堿和雷公藤的Q和Q%對(duì)t（h）分別按零級(jí)、一級(jí)與Higuchi動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行線性回歸，可知2種巴布劑的經(jīng)皮滲透可較好地?cái)M合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。青藤堿在STP、STEP中的r分別為0.9951、0.9926；透皮速率（J）分別為 21.729、20.063 μg·cm－2·h－1。雷公藤甲素在STP、STEP中的r分別為0.9942、0.9902；J分別為0.4783、0.4168 μg·cm－2·h－1。STP與STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外透皮動(dòng)力學(xué)方程分別見(jiàn)表3、表4。和Q%。

表3 STP與STEP中青藤堿的體外透皮動(dòng)力學(xué)方程Tab 3 Transdermal rate parameters and equations of sinomenine in STPand STEP

表4 STP與STEP中雷公藤甲素的體外透皮動(dòng)力學(xué)方程Tab 4 Transdermal rate parameters and equations of triptolide in STPand STEP

2.4 藥物釋放機(jī)制探討

將STP、STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外釋放數(shù)據(jù)代入Ritger-Peppas：Q%＝ktn模型進(jìn)行擬合，判斷其從巴布劑中釋放的機(jī)制，并將兩者進(jìn)行比較。結(jié)果，2種巴布劑中各組分體外釋放的擴(kuò)散指數(shù)0.45＜n＜0.89，說(shuō)明藥物的釋放機(jī)制是非Fick擴(kuò)散（藥物的擴(kuò)散和骨架溶蝕協(xié)同作用）；2種巴布劑中各組分的體外透皮指數(shù)n＜0.45，說(shuō)明藥物的透皮機(jī)制是Fick擴(kuò)散。STP與STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外Ritger-Peppas模型釋放參數(shù)見(jiàn)表5。

表5 STP與STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外Ritger-Peppas模型釋放參數(shù)Tab 5 Ritger-Peppas model release parameter of sinomenine and triptolide in STPand STEP

3 討論

釋放度是指藥物從該制劑在規(guī)定的溶劑中釋放的速度和程度。經(jīng)皮給藥過(guò)程包括藥物在基質(zhì)中擴(kuò)散、在皮膚表面分配、通過(guò)皮膚滲透3個(gè)連續(xù)過(guò)程。故巴布劑的溶出度或釋放度測(cè)定在一定程度上可反映藥物在經(jīng)皮給藥裝置中的傳遞性能，為評(píng)價(jià)給藥過(guò)程的限速步驟提供參考數(shù)據(jù)。

對(duì)于經(jīng)皮給藥制劑釋放度研究，目前公認(rèn)的試驗(yàn)方法是采用藥典所規(guī)定的釋放度測(cè)定第三法（小杯法），故本研究采用小杯法。小杯法中制劑的狀態(tài)較為穩(wěn)定，攪拌對(duì)基質(zhì)的影響較小，溶出液澄明度好。本研究采用的溶出介質(zhì)為30%乙醇生理鹽水溶液，在長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)中，應(yīng)注意溶出過(guò)程中的介質(zhì)蒸發(fā)量，這種損失量可能對(duì)釋放度測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響。

2種巴布劑中的有效成分體外經(jīng)皮滲透行為略有所不同。單體入藥的青藤堿、雷公藤甲素透皮速率均稍大于浸膏入藥的2種成分；但浸膏入藥的STEP時(shí)滯較小，推測(cè)與浸膏中其他成分存在有關(guān)。

藥物的經(jīng)皮吸收過(guò)程包括擴(kuò)散和代謝2個(gè)過(guò)程。許多藥物的藥理作用的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間取決于在機(jī)體中的代謝失活情況。所有進(jìn)入活性皮膚中的藥物分子及經(jīng)皮全身性吸收的藥物分子都要經(jīng)過(guò)皮膚中酶的代謝作用。體外通透試驗(yàn)很少能獲得有關(guān)代謝、分布和血流對(duì)通透性影響的信息，所以在體的透皮實(shí)驗(yàn)研究很有必要[6]。

因體外釋放與體外透皮濃度變化范圍較大，故采用2條標(biāo)準(zhǔn)曲線以滿足不同檢測(cè)濃度需要；體外釋放與體外透皮取樣后，經(jīng)過(guò)氮?dú)獯蹈杉状级ㄈ莺蟀瓷V條件進(jìn)樣，對(duì)此過(guò)程造成的測(cè)量誤差進(jìn)行了回收率試驗(yàn)，結(jié)果表明該處理方法簡(jiǎn)單、回收率良好。

在主要有效成分含量相同、基質(zhì)相同的STP、STEP巴布劑中，體外釋放因?yàn)槿艹鼋橘|(zhì)量較大，與成分的飽和濃度相差較遠(yuǎn)，故單體入藥與浸膏入藥釋放速率相近，無(wú)顯著性差異。而皮膚透過(guò)試驗(yàn)中，因?yàn)閱挝幻娣e皮膚對(duì)透過(guò)量有飽和性，在其他成分存在的情況下，可能會(huì)限制有效成分的透過(guò)速率，所得浸膏入藥的透皮速率低于單體入藥的透皮速率。

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