Survivin基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞體外抗凋亡能力的影響

范紅杰，王倩，馮娟，于維東，張強

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院干診科，沈陽110001）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）作為重要的組織工程種子細胞，具有多分化潛能，有促進造血重建、免疫調(diào)節(jié)等作用，并且易于接受外源基因的轉(zhuǎn)染和表達［1］。研究表明，BMSCs能重塑受損的神經(jīng)元通路和改善神經(jīng)功能缺失，可成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的種子細胞［2］。而單純的將BMSCs移植入體內(nèi)后的低成活率使BMSCs的治療效果不盡如人意。因此，如何減少其移植后凋亡的發(fā)生、提高BMSCs在體內(nèi)的存活率是目前干細胞移植治療腦缺血亟待解決的問題。存活素（Survivin）是一個近期發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族成員，是至今發(fā)現(xiàn)分子量最小的、作用最強的凋亡抑制因子，且與細胞分裂、增殖等密切相關(guān)，有促進細胞轉(zhuǎn)化并且參與細胞的有絲分裂、血管生成等作用［3］。本實驗旨在研究Survivin基因修飾的BMSCs在離體微環(huán)境中能否延長其生存能力并探討其機制，為新的干細胞抗凋亡移植策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM低糖型細胞培養(yǎng)基，購自美國Gibco BRL公司；0.25%EDTA胰蛋白酶，購自美國Sigma公司；胎牛血清，購自美國 Gibco公司；PBS（pH7.2）、TRIZOL（Invitrogen公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自美國Promege公司；PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖，均由日本TaKaRa公司提供；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所。實驗動物為6～8周齡、體質(zhì)量100～150 g的清潔級雄性SD大鼠10只，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物使用許可證號為SYXK（遼）2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)：取6～8周齡SD大鼠頸椎脫臼法處死，鈍性分離肌肉組織，完全暴露股骨和脛骨。從股骨和脛骨連接處小心分離，用止血鉗夾住股骨末端輕輕旋轉(zhuǎn)外拉取出股骨，立即置于裝有20 mL無血清低糖DMEM培養(yǎng)基的小燒杯中。依次取出另一側(cè)股骨和兩側(cè)的脛骨，剪去骨頭兩端的軟骨，抽取含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基5 mL，將針頭插入骨髓腔反復(fù)沖洗，棄上清，用5 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)移至25 mL培養(yǎng)瓶中，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約24 h換液去除懸浮生長的細胞和死細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，并棄掉未貼壁細胞，每日觀察細胞生長狀況，待細胞融合至80%～90%開始傳代，標(biāo)記至P3代。分為3組：MSC組（正常血清培養(yǎng)）、BMSC組（無血清培養(yǎng)48 h）和BMSC-Survivin組（無血清培養(yǎng)48 h）。

1.2.2 真核表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：收獲處于對數(shù)生長期的BMSCs，以5×104/孔轉(zhuǎn)種于6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細胞長至80%融合。轉(zhuǎn)染率的測定通過流式細胞儀檢測并分析未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染Survivin基因組的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達率。

1.2.3 RT-PCR檢測Survivin基因表達情況：應(yīng)用Primer3設(shè)計引物，以待檢測細胞的cDNA為模板，引 物 為 ：5′-ACCGCATCTACACCTTCAA-3′和5′-AGTGCTTCCTATGCTCCT CTAT-3′，擴增長度192 bp；內(nèi)參基因β-actin引物序列為5′-GTTGCGTTAC ACCCTTTCTT-3′和5′-CGAAGGCTCATCATTCAAA A-3′，擴增長度443 bp，由北京三博遠志生物工程服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后按 94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃ 45 s進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物取10 μL加2 μL 6×上樣緩沖液，電泳，紫外成像儀獲取圖像，軟件分析。

1.2.4 BMSCs對去血清凋亡的檢測：待檢測的細胞及對照細胞倒掉培養(yǎng)液，PBS洗后用0.25%胰酶消化1.5 min，倒掉胰酶，PBS小心洗1次，用PBS吹打1 min成細胞懸液，吸入Appendorf管，4℃、1000 r/min離心1 min，然后PBS重懸，4℃、1000 r/min離心2次，以PBS重懸后調(diào)整細胞密度至5×106/mL，加入10 mL AnnexinⅤ混勻，室溫暗處溫育染色15 min，在上機前5 min加入10 mg/L碘化丙錠（propidium iodide，PI）染液5 mL。用FACS流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數(shù)，觀察凋亡細胞百分比。分為3組：未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染Survivin基因組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，應(yīng)用方差分析或成組t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

接種初始的BMSCs為圓形，散在分布。48 h后細胞基本貼壁，并且有集落形成，進行第1次換液。換液后清除懸浮細胞，BMSCs開始貼壁生長，第7天左右細胞可鋪滿瓶底。傳代后隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞迅速增多，呈細長狀有突起為漩渦狀生長，其間分布有散在黑色顆?？赡転轲じ叫詮姷难毎?，胰蛋白酶消化傳代后逐漸消失，第3代時可見細胞以梭形為主。

2.2 流式細胞儀分析細胞的轉(zhuǎn)染率

未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染Survivin基因組細胞的GFP表達率分別為1.3%、35.3%和32.8%（圖1）。

2.3 RT-PCR檢測Survivin基因表達結(jié)果

Survivin/β-actin比 值 MSC 組 、BMSC 組 和BMSC-Survivin 組分別為1.17、1.13 和1.75，Survivin基因表達量BMSC-Survivin組較MSC組和BMSC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），MSC組和BMSC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

2.4 Survivin基因轉(zhuǎn)染對BMSC細胞凋亡的影響

去血清培養(yǎng)后BMSC組的早期凋亡率（2.84%）較 MSC 組（2.45%）升高（P<0.05）；血清培養(yǎng) 48 h后，BMSC-Survivin組（0.89%）較BMSC組的早期凋亡率降低（P<0.05），見圖3。

3 討論

關(guān)于BMSCs的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點，BMSCs具有來源廣泛、取材方便、體外分離和擴增簡便等優(yōu)點，自體移植無免疫排斥反應(yīng)，避開了倫理學(xué)爭議，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。BMSCs能轉(zhuǎn)染和長期表達外源性基因，近期已從單純的BMSCs移植發(fā)展到經(jīng)處理后再移植。但是BMSCs有其局限性，由于在體存活時間短，使其促進血管再生成、分泌營養(yǎng)因子等作用并不顯著，所以減少BMSCs的凋亡率是充分發(fā)揮干細胞潛能的關(guān)鍵。Survivin是一種凋亡抑制基因，Survivin在腫瘤組織中高表達，在分化成熟的正常組織中不表達［4］，可作用于細胞周期的G2/M期，與細胞分裂、增殖等密切相關(guān)，有促進細胞轉(zhuǎn)化并且參與細胞的有絲分裂、血管生成等作用［5］。因此，本實驗選擇Survivin作為外源基因，通過脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至BMSCs，旨在發(fā)揮Survivin基因的抗凋亡作用，延長BMSCs的生存時間，使細胞治療與基因治療相結(jié)合，充分發(fā)揮治療作用。

本實驗采用國內(nèi)外主流的Annexin V/PI方法檢測凋亡早期細胞。細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別難度較大。Annexin V是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，具有易于結(jié)合到磷脂類如磷脂酰絲氨酸的特性，對磷脂酰絲氨酸有高度的親和性，因此該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的磷脂酰絲氨酸［6］。磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就已破壞。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞中，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染［7］。因此，本實驗將Annexin-V與PI匹配使用，建立一種用Annexin V在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合PI染料排除試驗，以區(qū)分凋亡早晚期的細胞以及死細胞。

實驗研究結(jié)果顯示，Survivin基因轉(zhuǎn)染后可降低大鼠BMSCs去血清培養(yǎng)后的早期凋亡率，使細胞存活時間延長。但是，其確切的機制有待于進一步的研究和證實。目前認為，Survivin抗凋亡作用的機制可能為：（1）直接抑制細胞凋亡蛋白酶導(dǎo)致細胞凋亡通路受阻而起到抑制凋亡的作用，這是由于它含有的BIR2功能區(qū)，可在Bcl-2的下游與caspase-3和caspase-7結(jié)合而直接抑制其活性；（2）通過抑制位于染色體同一基因簇并且編碼序列廣泛互補的效應(yīng)細胞蛋白酶受體1轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Survivin，從而減少細胞的凋亡，即Survivin與效應(yīng)細胞蛋白酶受體1相互作用來調(diào)節(jié)細胞的凋亡；（3）抑制細胞色素C和caspase-8誘導(dǎo)的caspase的激活，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用；（4）與細胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4結(jié)合，形成Survivin/CDK4復(fù)合物，該復(fù)合物使p21被釋放，從而使CDK4與Procaspase相互作用抑制細胞凋亡［8，9］。

此外，Liu等［10］的研究顯示轉(zhuǎn)染后的干細胞可能是由于提高干細胞的存活率和上調(diào)VEGF和bFGF保護因子的分泌來達到治療作用的，而VEGF和bFGF保護因子的升高可能是BMSCs生存時間提高的結(jié)果。如何提高治療作用的關(guān)鍵在于如何提高干細胞的生存時間，所以Survivin提高干細胞的生存時間是今后研究的重要方向，其機制需要再進一步的研究，使轉(zhuǎn)基因治療缺血性腦血管病以及其他器官疾病的治療成為可能。同時本實驗也存在一些不足之處：（1）沒有充分的證據(jù)證明BMSCs轉(zhuǎn)染后的多分化性和保護因子的高分泌，需要下一步的實驗及體內(nèi)實驗繼續(xù)研究；（2）Survivin基因轉(zhuǎn)染后增強BMSCs抗凋亡能力的確切機制仍不明確，有待于進一步研究和探討。

總之，本實驗結(jié)果提示轉(zhuǎn)染Survivin基因?qū)MSCs具有保護作用，可降低去血清培養(yǎng)的早期凋亡率，延長其存活時間，使解決BMSCs在體內(nèi)凋亡率高的問題有了新的突破，從而為臨床治療提供了一個新的思路。

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