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    曲妥珠單抗與順鉑序貫聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制作用的研究

    2012-12-03 02:34:58吳志勇孫勝杰焦順昌解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科北京100853
    關(guān)鍵詞:單藥法測(cè)定抑制率

    吳志勇,孫勝杰,焦順昌(解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科, 北京 100853)

    HER-2(human epidermal growth factor receptors-2)基因的過度表達(dá)是乳腺癌的重要預(yù)后不良因素。曲妥珠單抗(赫賽汀,trastuzumab)是以HER-2/neu蛋白為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的人源化單克隆抗體。大量研究表明,曲妥珠單抗可明顯提高化療對(duì)HER-2/neu過度表達(dá)乳腺癌的療效,并可廣泛應(yīng)用于治療的各個(gè)階段[1]。但是在聯(lián)合治療方案中,曲妥珠單抗的使用最佳時(shí)機(jī)仍有待明確,因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了關(guān)于曲妥珠單抗聯(lián)合化療序貫方式研究的系列實(shí)驗(yàn),已報(bào)道的曲妥珠單抗與多西他賽、吉西他濱的序貫聯(lián)合應(yīng)用的結(jié)果,與臨床應(yīng)用情況基本吻合[2-4]。本文旨在尋找曲妥珠單抗與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的最佳序貫方式,并初步探討其機(jī)制,從而為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 藥品和試劑 MI/1640培養(yǎng)液(美國GIBCO公司);胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所);MTT(美國AMRESCO公司);順鉑(齊魯制藥);曲妥珠單抗(上海羅氏制藥)。

    1.1.2 主要設(shè)備 二氧化碳孵箱(美國Baxter);96孔板(美國COSTOR3599);酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司,型號(hào):Multiskan MK3353);YKH2 Ⅱ型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)。

    1.2 方法

    人乳腺癌細(xì)胞珠MDA-MB453其Her-2/neu基因擴(kuò)增為陽性,由解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科提供,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。

    1.2.1 MTT 法測(cè)定藥物作用抑制率 將2.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板(200 μL/孔),培養(yǎng)24 h;將藥物按照不同濃度加入,共培養(yǎng)60 h;加入5% MTT 20 μL/孔,4 h后加入DMSO 200 μL/孔,振蕩;用酶標(biāo)儀(波長492 nm) 測(cè)定OD 值,最后結(jié)果取均值,以未處理組作為對(duì)照組,按下列公式計(jì)算各組的抑制率:抑制率(%) = 1– (實(shí)驗(yàn)組OD492/ 對(duì)照組OD492)×100 %。

    1.2.2 MTT法測(cè)定順鉑與曲妥珠單抗以不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用的抑制率 分別設(shè)立DDP前24 h應(yīng)用HER組、DDP前18 h應(yīng)用HER組、DDP前12 h應(yīng)用HER組、DDP前6 h應(yīng)用HER組、DDP+HER同時(shí)作用組、DDP后6 h應(yīng)用HER組、DDP后12 h應(yīng)用HER組、DDP后18 h應(yīng)用HER組、DDP后24 h應(yīng)用HER組序貫結(jié)合方式。將順鉑與曲妥珠單抗加入孔中。順鉑加入后培養(yǎng)60 h,MTT法測(cè)定各組的OD值,重復(fù)操作3次,取平均值,計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組抑制率。

    利用以下金氏公式計(jì)算參數(shù)Q判斷兩藥的合并用藥效應(yīng):

    其中,Ea代表HER的抑制率,Eb代表DDP的抑制率,E(a+b)為兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制率,即實(shí)測(cè)合并效應(yīng),分母 Ea+ Eb– Ea*Eb為期望合并效應(yīng),Q 為兩者相比。Q 值在 0.85 ~ 1.15 時(shí),合并效應(yīng)為相加作用,Q值> 1.15為協(xié)同作用,Q 值< 0.85 為拮抗作用[5]。

    流式細(xì)胞儀分析DDP與HER以不同序貫方式聯(lián)合對(duì)MDA-MB453細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,單因素方差分析比較各組,數(shù)據(jù)以(±s) 表示,P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MTT 法測(cè)定藥物作用于MDA-MB453 細(xì)胞抑制率

    通過計(jì)算得出DDP 30%抑制率濃度約為29.17 μg·mL-1。HER 15%抑制率約為7.19 μg·mL-1。

    2.2 MTT 法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組抑制率及Q值

    結(jié)果見表1。結(jié)果表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果均好于單藥DDP組的抑制率(30.98%,P < 0.01);其中兩藥同時(shí)應(yīng)用組及加入DDP后應(yīng)用HER組聯(lián)合抑制率明顯高于在DDP前應(yīng)用HER組,Q值提示各組均為相加作用,其中以兩藥同時(shí)使用時(shí)相加作用效果最好(Q = 1.106)。

    表1 不同序貫方式順鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

    表1 不同序貫方式順鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

    注:聯(lián)合作用組抑制率與單藥DDP抑制率間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, *P < 0.01;兩藥同時(shí)應(yīng)用組Q值與其他組Q值間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,**P < 0.01Note:the difference of inhibition ratio between HER+DDP and DDP was statistically significant, *P < 0.01; Q-value difference between simultaneously combined group and other groups was statistically significant, **P < 0.01

    組別 HER抑制率/% HER + DDP抑制率/% Q值單藥DDP – 30.98±1.537 –加入DDP前24 h應(yīng)用HER 15.83±0.095 36.57±1.141* 0.872±0.012加入DDP前18 h應(yīng)用HER 17.58±0.291 39.71±1.192* 0.921±0.021加入DDP前12 h應(yīng)用HER 16.44±0.863 39.39±1.204* 0.930±0.062加入DDP前 6 h應(yīng)用HER 14.03±0.778 41.42±3.196* 1.018±0.055 DDP + HER同時(shí)應(yīng)用 20.46±1.298 49.88±1.531* 1.106±0.071**加入DDP后 6 h應(yīng)用HER 28.23±1.462 47.03±0.988* 0.932±0.060加入DDP后12 h應(yīng)用HER 26.61±1.353 48.04±1.386* 0.973±0.047加入DDP后18 h應(yīng)用HER 28.23±2.904 49.91±1.798* 0.988±0.103加入DDP后24 h應(yīng)用HER 28.71±2.481 50.80±1.675* 1.000±0.094

    2.3 流式細(xì)胞儀分析順鉑與曲妥珠單抗以不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞周期的影響

    結(jié)果見表2。結(jié)果表明,與單藥DDP化療組相比,DDP前應(yīng)用HER組G0/G1、S期細(xì)胞所占比例減少,G2/M期細(xì)胞增多,而其他組則未見明顯變化,提示此組中兩藥的相加作用較弱與細(xì)胞周期的影響有關(guān)。

    3 討論

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:曲妥珠單抗與順鉑聯(lián)合應(yīng)用抑制作用強(qiáng)于單藥順鉑,其機(jī)制在于:HER-2過度表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,聯(lián)合使用曲妥珠單抗可引起HER-2蛋白的內(nèi)化,而減少表達(dá),從而提高腫瘤細(xì)胞化療敏感性,而取得較好的抑制率[6-7]。此外,順鉑作用于細(xì)胞DNA引起損傷的啟動(dòng)自身保護(hù)機(jī)制─非常規(guī)DNA合成進(jìn)行DNA修復(fù),Pietras RJ等[8]證明順鉑聯(lián)合使用曲妥珠單抗可明顯減少順鉑引起的非常規(guī)DNA合成,從而取得較好的治療效果。

    表2 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)曲妥珠單抗與順鉑處理后各細(xì)胞周期的變化.%,n = 3,±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

    表2 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)曲妥珠單抗與順鉑處理后各細(xì)胞周期的變化.%,n = 3,±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

    注:聯(lián)合作用組細(xì)胞周期與單藥DDP進(jìn)行單因素方差分析,*P < 0.01Note: one-factor analysis of variance of cell cycle between combined treatment group and DDP group, *P < 0.01

    組別 G0/G1 S G2/M對(duì)照組 56.27±0.87 30.69±1.43 13.04±0.65單藥DDP 51.85±2.52 26.09±2.11 22.05±0.72單藥HER 65.32±2.32 24.11±1.73 10.57±2.15加入DDP前12 h應(yīng)用HER 30.94±2.01* 21.64±1.34* 47.42±3.38*DDP+HER同時(shí)應(yīng)用 49.60±1.37 24.79±1.93 25.61±2.82加入DDP后6 h應(yīng)用HER 53.89±2.04 24.61±1.45 21.50±0.93

    在兩藥不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用的對(duì)比中發(fā)現(xiàn),順鉑前應(yīng)用曲妥珠單抗效果較差??赡芤?yàn)轫樸K主要針對(duì)增殖活躍的細(xì)胞,而先使用曲妥珠單抗會(huì)使腫瘤細(xì)胞停止在G0/G1期而降低了腫瘤細(xì)胞的增殖活性,所以也在一定程度上降低了對(duì)細(xì)胞毒藥物的敏感性。細(xì)胞周期結(jié)果顯示:與單藥順鉑比較,先應(yīng)用曲妥珠單抗后應(yīng)用順鉑組出現(xiàn)了明顯的S、G2/M期阻滯,但對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用卻沒有明顯增高??赡苁且?yàn)閼?yīng)用曲妥珠單抗后激活了一些通路增加S、G2/M期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)而增強(qiáng)了細(xì)胞DNA修復(fù)[9],降低了兩藥聯(lián)合的抑制作用。

    本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了曲妥珠單抗與順鉑對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用及對(duì)細(xì)胞周期的影響。并得出了兩藥不同序貫方式聯(lián)合使用時(shí),均表現(xiàn)為相加作用,其中同時(shí)應(yīng)用時(shí)效果最好,并利用流式細(xì)胞技術(shù)初步證明這種差異同細(xì)胞周期的變化有一定的關(guān)系。本次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用及研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),但是不同的個(gè)體、細(xì)胞系及亞群是否具有相同規(guī)律,是否還涉及到其他機(jī)制,還有待進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究。

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