鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的穩(wěn)定性研究

王東興，錢秋玉，孫建緒，高永良，張振清 （. 北京軍區(qū)總醫(yī)院63臨床部藥械科，北京 049；. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 00850）

用于全身系統(tǒng)疾病的治療，鼻腔給藥具有起效快、無首過消除作用、無損傷、使用方便等特點(diǎn)[1-2]，近年來發(fā)展迅速。嘔吐患者常常因惡心、嘔吐而不適合口服給藥，影響止吐藥物口服給藥的療效，因此，止吐藥物的鼻腔給藥日益受到重視[3]。鹽酸格拉司瓊是選擇性5-羥色胺3受體拮抗劑，目前國內(nèi)外已上市劑型有片劑、口服溶液劑和注射劑，用于預(yù)防和治療放化療引起的惡心和嘔吐以及各種手術(shù)后的惡心和嘔吐[4]。根據(jù)止吐藥物適合通過鼻腔給藥的特點(diǎn)[3]，我們開發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國家二類新藥—鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑，并已申請(qǐng)中國發(fā)明專利并獲得授權(quán)[5]，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。在該制劑開發(fā)過程中，我們按照國家新藥研究的有關(guān)規(guī)定對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

UV-160A紫外可見分光光度計(jì)（SHIMADZU）；tspP2000型高效液相色譜儀，tspUV1000型紫外檢測器，tsp4600型積分儀；pH計(jì)（HANNA HI931410）；萬分之一電子分析天平（Sartorius）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸格拉司瓊原料藥（太極集團(tuán)，純度99.9%，批號(hào)000815005）；羥苯乙酯（分析純，Sigma，批號(hào)54H3472）；鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑（自制，批號(hào)010416、010417、010418）；甲醇（色譜純，邯鄲四友生物科技有限公司）；無水乙酸鈉（分析純，溫州市試劑化工廠，批號(hào)961105）；三乙胺（分析純，天津市化學(xué)試劑六廠，批號(hào)980715）。

2 方法

2.1 穩(wěn)定性分析方法的建立

2.1.1 含量測定方法 色譜條件：Phenomenex prodigy ODS（3）色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol·L-1醋酸鈉緩沖液（50∶50，含0.25%三乙胺，冰醋酸調(diào)pH值至6）；流速 1 mL·min-1；檢測波長 301 nm；進(jìn)樣量 20 μL； 柱溫為30 ℃。

方法精密度：分別配制鹽酸格拉司瓊的低（1 μg·mL-1）、中（5 μg·mL-1）、高（10 μg·mL-1）濃度溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，分別計(jì)算三種濃度的色譜峰面積的RSD值。

鹽酸格拉司瓊工作液的穩(wěn)定性：分別配制鹽酸格拉司瓊的低（1 μg·mL-1）、中（5 μg·mL-1）、高（10 μg·mL-1）濃度溶液，分別在不同時(shí)間間隔進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，分別計(jì)算三種濃度的色譜峰面積的日內(nèi)差、日間差。

線性范圍：配制100 μg·mL-1的鹽酸格拉司瓊儲(chǔ)備液，分別稀釋成0.2、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg·mL-1的濃度，進(jìn)樣并記錄峰面積，以濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

方法的回收率實(shí)驗(yàn)：按照鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的處方，以102 μg·mL-1的鹽酸格拉司瓊儲(chǔ)備液和3.1 μg·mL-1的防腐劑儲(chǔ)備液制備低（1 μg·mL-1）、中（5 μg·mL-1）、高（10 μg·mL-1）三個(gè)濃度的鹽酸格拉司瓊?cè)芤?，其中防腐劑含量均?.155 μg·mL-1，按含量測定方法測定鹽酸格拉司瓊含量，計(jì)算回收率。

2.1.2 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑有關(guān)物質(zhì)檢查 鹽酸格拉司瓊分解產(chǎn)物干擾試驗(yàn)：分別以水、0.1 mol·L-1HCl、0.1 mol·L-1NaOH和3%H2O2為溶劑配制200 μg·mL-1的鹽酸格拉司瓊?cè)芤?，灌封? mL安瓿中，其中，3%H2O2為溶劑者置于40 ℃烘箱中，其余放入100 ℃烘箱中，分別于不同時(shí)間取樣，按照含量測定的HPLC方法進(jìn)樣，考察其分解情況及分解產(chǎn)物與鹽酸格拉司瓊色譜峰的分離情況。

鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑有關(guān)物質(zhì)檢查：按中國藥典2000版（二部）附錄V D中主成分自身對(duì)照法進(jìn)行。

2.2 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑穩(wěn)定性樣品的制備制備批號(hào)分別為010416、010417、010418的鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑各100瓶，用于穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，檢測各批樣品的pH值、外觀、含量及有關(guān)物質(zhì)。

2.2.2 加速實(shí)驗(yàn) 將三個(gè)批號(hào)的鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑置于40 ℃烘箱中，分別于第1、2、3、6月取樣，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)各考察指標(biāo)的檢測。

2.2.3 室溫長期留樣 將三個(gè)批號(hào)的鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑置于室溫環(huán)境中，分別于第3、6、9、12、18、24、36月取樣，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)各考察指標(biāo)的檢測。

3 結(jié)果

3.1 穩(wěn)定性分析方法的建立

3.1.1 含量測定方法 方法精密度：鹽酸格拉司瓊的低（1 μg·mL-1）、中（5 μg·mL-1）、高（10 μg·mL-1）濃度溶液分別進(jìn)樣后的色譜峰面積平均RSD值為0.61%（n = 15），方法的精密度良好。

鹽酸格拉司瓊工作液的穩(wěn)定性：鹽酸格拉司瓊的低（1 μg·mL-1）、中（5 μg·mL-1）、高（10 μg·mL-1）濃度溶液分別進(jìn)樣后的色譜峰面積日內(nèi)差RSD值＜ 1.17%，日間差RSD值 ＜ 1.67%，工作液穩(wěn)定性良好。

線性范圍：鹽酸格拉司瓊?cè)芤涸?.2 ～ 20.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)對(duì)色譜峰面積的回歸方程如下：Y = 89 061.701 7X – 4 686.669 7，r = 0.999 96（n = 3），藥物濃度與色譜峰面積之間線性關(guān)系良好。

方法的回收率實(shí)驗(yàn)：低（1 μg·mL-1）、中（5 μg·mL-1）、高（10 μg·mL-1）三個(gè)濃度的鹽酸格拉司瓊?cè)芤旱幕厥章史謩e為（100.98±1.25）%、（100.43±0.82）%、（100.83±0.71）%，表明該測定方法準(zhǔn)確，回收率符合含量測定的要求。

鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的含量測定方法：精密吸取鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑溶液1 mL于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密吸取該溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取鹽酸格拉司瓊對(duì)照品，精密稱取適量，用水溶解并定量稀釋成每1 mL中約含5 μg（以格拉司瓊游離堿計(jì)）的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

3.1.2 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑有關(guān)物質(zhì)檢查 鹽酸格拉司瓊分解產(chǎn)物干擾實(shí)驗(yàn)：在中性、酸性、堿性和氧化條件下，鹽酸格拉司瓊均產(chǎn)生一個(gè)分解產(chǎn)物，其色譜峰在色譜圖中的保留時(shí)間均相同，并且與鹽酸格拉司瓊色譜峰分離良好。鹽酸格拉司瓊在3%H2O2中分解最快，其次為0.1 mol·L-1NaOH溶液和0.1 mol·L-1HCl溶液，在水中最穩(wěn)定。鹽酸格拉司瓊在0.1 mol·L-1NaOH溶液中的分解產(chǎn)物色譜圖見圖1。因此，在該色譜條件下，鹽酸格拉司瓊分解產(chǎn)物不會(huì)干擾鹽酸格拉司瓊的含量測定，該方法適合于鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的穩(wěn)定性分析。

圖1 鹽酸格拉司瓊在0.1 mol·L-1NaOH溶液中的分解產(chǎn)物色譜圖1 – 分解產(chǎn)物；2 – 鹽酸格拉司瓊Fig 1 Chromatogram of degradation products of granisetron hydrochloride in 0.1 mol·L-1NaOH solution1 – degradation products; 2 – granisetron hydrochloride

鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑有關(guān)物質(zhì)檢查：精密吸取鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑溶液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為樣品溶液；精密吸取樣品溶液1 mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；在鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑穩(wěn)定性分析方法的色譜條件下，首先取上述對(duì)照溶液進(jìn)樣，記錄鹽酸格拉司瓊色譜峰的峰面積，再取上述樣品溶液進(jìn)樣，記錄色譜峰至鹽酸格拉司瓊色譜峰保留時(shí)間的兩倍，除溶劑峰和鹽酸格拉司瓊色譜峰外的雜峰峰面積之和應(yīng)小于對(duì)照溶液的鹽酸格拉司瓊色譜峰的峰面積。

3.2 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3.2.1 穩(wěn)定性樣品的檢測結(jié)果 具體見表1。

表1 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑穩(wěn)定性樣品測定結(jié)果Tab 1 Test results of granisetron hydrochloride nasal spray samples for stability study

3.2.2 加速實(shí)驗(yàn) 加速實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三批樣品在40℃、RH75%下放置6個(gè)月，外觀、pH值、主藥含量、有關(guān)物質(zhì)檢查等均符合規(guī)定。 0天和6個(gè)月的結(jié)果見表2。

3.2.3 室溫長期留樣觀察 室溫長期留樣36個(gè)月的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：三批樣品外觀、pH值、主藥含量、有關(guān)物質(zhì)檢查等均符合規(guī)定。0天和36個(gè)月的結(jié)果見表3。

表2 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑加速實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of accelerated test on granisetron hydrochloride nasal spray

表3 鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑室溫長期留樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of long term observation on granisetron hydrochloride nasal spray

4 討論

對(duì)于嘔吐患者來說，口服給藥依從性較差，而注射給藥不僅需要專業(yè)的人員和特定的環(huán)境，對(duì)人體還會(huì)產(chǎn)生一定的損傷，因此，止吐藥的新給藥途徑研究日益受到重視，其中，鼻腔給藥途徑尤為引人注目[3]。鹽酸格拉司瓊的新給藥途徑研究有鼻腔給藥[6-10]和透皮給藥[11]的文獻(xiàn)報(bào)道，以鼻腔給藥的報(bào)道居多。

上述報(bào)道多為鹽酸格拉司瓊鼻腔給藥的藥物動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)方面的研究，而要將其開發(fā)成新藥并應(yīng)用于臨床，制劑學(xué)的研究不可或缺。穩(wěn)定性研究作為新藥研究中制劑學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，對(duì)于保證藥品質(zhì)量具有重要意義，故而我們對(duì)鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。經(jīng)過6個(gè)月的加速實(shí)驗(yàn)和36個(gè)月的長期留樣觀察，鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的外觀、pH值、主藥含量、有關(guān)物質(zhì)等各項(xiàng)考察指標(biāo)均符合規(guī)定，該制劑穩(wěn)定性良好。鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑的穩(wěn)定性研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道，本研究可為同類研究提供參考。本文結(jié)果還可為將來鹽酸格拉司瓊鼻腔噴霧劑之上市產(chǎn)品的有效期制定提供參考，但上市產(chǎn)品的有效期仍要以實(shí)際大生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性研究后確定。