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    酸馬奶分離到的乳酸菌分子鑒定

    2012-12-02 00:57:50金山白雅莉趙洪鑫芒來
    食品研究與開發(fā) 2012年1期
    關(guān)鍵詞:馬奶乳酸桿菌瑞士

    金山,白雅莉,趙洪鑫,芒來

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古科技信息研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;3.內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

    蒙醫(yī)藥典中記載:“酸馬奶味酸、甘、澀?!彼崮荛_胃、助消化、祛濕、行氣,甘能健身補(bǔ)弱、疏通食道、治傷、接骨、解毒、增強(qiáng)五官功能,澀能治血熱、化淤血、消肥胖、祛腐生肌、潤(rùn)皮膚[1]。在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn),酸馬奶具有降血脂[2]、降膽固醇[3]、降血壓、治療便秘、抑制結(jié)核菌生長(zhǎng)、貧血和改善糖尿病等功效。為了研究這些功效產(chǎn)生的因素,中外學(xué)者分別對(duì)酸馬奶的成分、微生物群組成、酸度、蛋白質(zhì)成分、微量元素組成等進(jìn)行了詳盡的研究。根據(jù)酸馬奶擁有馬奶所不具備的功效,而其成分最大的不同是由酸馬奶中微生物群體造成的;酸馬奶中微生物群的構(gòu)成成為了研究重點(diǎn),已經(jīng)得出的研究成果中,其結(jié)論各不相同,大體上以酵母菌菌群和乳酸菌菌群為主。本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)為酸馬奶中的乳酸菌。

    國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)酸馬奶中的微生物進(jìn)行了研究,其分離結(jié)果均不相同。日本學(xué)者Ishii等從中國(guó)內(nèi)蒙古的酸馬奶樣品中分離到了包括乳酸桿菌Lb.paracasei subsp.paracasei亞種、Lb.rhamnosus和Lb.curvalus等乳酸菌及乳酒假絲酵母和馬克斯克魯維酵母等乳糖發(fā)酵酵母[4]。賀銀鳳等從15份酸馬奶樣品中分離出乳酸桿菌Lb.casei subsp.casei、Lb.sanfranciso、Lb homohiochii、Lb.sharpeae、Lb.jenesenii和Lb.maltaromicus,球菌Lc.mesenteroedes subsp.dextranium、E.faecalis、Laccoccus lactis、Streptococcus、E.durand等,以及酵母菌共53株[5]。Ying AN等對(duì)分離自中國(guó)內(nèi)蒙古酸馬奶中的乳酸菌進(jìn)行了研究,認(rèn)為以L.plantarum和L.pentosus為主[6]。李少英等從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的酸馬奶樣品中分離到乳酸桿菌L.acidophilus和L.casei共12株[7]。石井等從蒙古國(guó)酸馬奶中分離到的乳酸桿菌以L.plantarum為優(yōu)勢(shì)菌[8]。Burentegusi等從內(nèi)蒙古酸馬奶樣品中也分離到L.paracasei subsp.paracasei、L.coryniformis subsp.coryni formis、L.curvatus、L.kefiranofaciens等同型發(fā)酵乳酸菌[9-10]。孫天松等從新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶中分離得到152株菌株,分別為:Lactobacillus helveticus(占總分離株的51.3%),其次為L(zhǎng).acidophilus(18.4%)和L.casei subsp.pseudoplantarum(8.6%),以及L.gasseri、L.casei subsp.casei、L.curvatus、L.sanf rancisco、L.coryniformis subsp.coryniformis、L.brevis、L.plantrum、L.homohiechill、L.fermentum、L.dellbrueckii subsp.bulgaricu、L.ruminis、L.crispatus、L.farciminis和L.hilgardii等數(shù)量較少(1株~4株)的菌株[11]。

    酸馬奶中的微生物類群比較復(fù)雜,在不同地區(qū)、不同家庭中以傳統(tǒng)方法制作的酸馬奶中微生物成分不同。酸馬奶所具有的醫(yī)療保健作用與其所含有的微生物菌群有著密切的關(guān)系。因此,在本實(shí)驗(yàn)的研究過程中,仍然需要繼續(xù)進(jìn)行酸馬奶中乳酸菌的分離與鑒定。由于分子鑒定比較快捷和準(zhǔn)確,逐漸成為鑒定菌種的常用方法。本實(shí)驗(yàn)采用分子鑒定對(duì)從酸馬奶中分離得到的11株乳酸菌進(jìn)行鑒定。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 材料

    內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗的3份酸馬奶樣品中分離的11株乳酸菌。由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.1.2 試劑

    醋酸鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS):Sigma公司分裝;三氯甲烷(Chloroform)、異戊醇(Isopentanol)、無水乙醇(Ethanol):A.R,天津化學(xué)試劑二廠;三羥甲基氨基甲烷(Tris):Promega Corporation,USA;硼酸:北京市新光化學(xué)試劑廠;乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O):華美生物工程公司;Tris飽和酚:北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司;瓊脂糖(Agrose):TAKARA分裝;超級(jí)2×Taq Master Mix,是一種可以立即使用的PCR預(yù)混液,含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、標(biāo)準(zhǔn)Taq酶反應(yīng)緩沖液及染料,使用時(shí)只需要在溶液中加入模板和引物即可?;旌弦褐泻袖宸铀{(lán)染料,PCR反應(yīng)結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳:南京博爾迪生物科技有限公司。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    紫外分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司;數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng):ALPHA INNOTECH公司;電泳儀、水平電泳槽:北京六一儀器廠;9700型PCR儀:美國(guó)PERKIN ELMER公司;高速立式冷凍離心機(jī):BECKMAN公司;220V穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀:南京大學(xué)。

    1.2 方法

    1.2.1 乳酸桿菌培養(yǎng)及基因組DNA提取

    將冷凍保存的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中,置37℃培養(yǎng)24 h,經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代3次后,取5 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的具體培養(yǎng)物,3000 r/min離心5 min收集菌體?;蚪MDNA的提取方法采用CTAB法[6],流程如圖1。

    圖1 基因組DNA提取流程圖Fig.1 The flow chart of DNA genome extracting

    1.2.2 16s rDNA基因擴(kuò)增

    本實(shí)驗(yàn)所需引物選自參考文獻(xiàn)[12],預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為1500 bp左右。

    P1(上游引物):5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

    P2(下游引物):5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′

    本實(shí)驗(yàn)所建立的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如表1、2。

    表1 PCR反應(yīng)體系及用量Table 1 The composition and quantities of PCR

    表2 PCR擴(kuò)增條件Table 2 The optimized conditions of PCR

    1.2.3 目的基因的純化回收、克隆

    目的基因的純化回收采用多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行,克隆采用pGM-T克隆試劑盒(北京天根生物有限公司)進(jìn)行。將菌液送至大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.2.4 序列分析方法

    利用BLAST,將所測(cè)定的菌株序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株序列進(jìn)行比對(duì),尋找與目的基因序列同源性最高的已分類的菌種,然后提取該菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列(菌株序列名稱見表3),利用軟件MEGA進(jìn)行序列分析,以鄰域連接法(Neighber join,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,最終進(jìn)行菌種鑒定。

    表3 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的乳酸桿菌菌株Table 3 The standard strains of the NJ tree

    2 結(jié)果

    2.1 分子鑒定結(jié)果

    2.1.1 目的基因電泳檢測(cè)結(jié)果

    目的基因電泳檢測(cè)結(jié)果,見圖2。

    圖2 目的基因電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of target gene

    2.1.2 測(cè)序結(jié)果分析

    將測(cè)序結(jié)果利用軟件MEGA進(jìn)行序列分析,比對(duì)結(jié)果如下。

    經(jīng)比對(duì),將11株測(cè)序菌株判定為瑞士乳桿菌,與已知的瑞士乳桿菌序列(見表4)比對(duì),其突變位點(diǎn)如圖3。

    表4 已知16 S rRNA/rDNA序列的瑞士乳桿菌菌株Table 4 The Lactobacillus helueticus strains with known 16S rRNA/rDNA sequence

    將所測(cè)菌株序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)所測(cè)菌株中菌株17、37和51為一支,菌株4、24、29、30、39、63、64和66為一支,而且均與瑞士乳桿菌菌株的同源性較高,初步將這11株菌株判定為瑞士乳桿菌。將這11株菌株與已知的瑞士乳桿菌序列進(jìn)行堿基序列分析,發(fā)現(xiàn)菌株之間堿基差異較大的位點(diǎn)為170、508、725、1220,且都為C-T之間的轉(zhuǎn)換。

    3 討論

    酸馬奶中的微生物類群比較復(fù)雜,在不同地區(qū)、不同家庭中以傳統(tǒng)方法制作的酸馬奶中微生物成分不同。本實(shí)驗(yàn)所用酸馬奶的酸度較高,其pH為3.8,對(duì)其中的微生物群體進(jìn)行分離鑒定,得到了以瑞士乳桿菌為主的菌群。本文中,對(duì)其中的11株菌株進(jìn)行了16 S rDNA同源性分析,得出:這11株菌株均為瑞士乳桿菌,且目的片段僅在個(gè)別可變位點(diǎn)上有區(qū)別,同源性較高。

    圖3 基于16 S rDNA序列建立的菌株NJ樹Fig.3 The NJ tree of the strains based on the 16S rDNA sequence

    圖4 16 S rRNA/rDNA部分堿基序列Fig.4 The sequence of 16S rRNA/rDNA

    [1]孟和畢力格,烏日娜,王立平,等.不同地區(qū)酸馬奶中乳桿菌的分離及其生物學(xué)特性的研究[J].中國(guó)乳品工業(yè),2004,32(11):6-11

    [2]扎木蘇,劉月英,金柱.酸馬奶降脂及抗凝作用50例臨床觀察[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,1994(8):16

    [3]高學(xué)云,芒來.發(fā)酵乳中功能性乳酸菌的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì),2007(17):39-40

    [4]Ishii S,Kikuchi M,Takao S.Isolation and Identification of lactic bacteria and yeasts from“Chigo”in Inner Mongolia,China,Anim[J].Sci Technol,1997,68(3):325-329

    [5]賀銀鳳,李少英,母智深,等.酸馬奶酒中微生物的分離鑒定及抗菌特性的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,2002,18(2):91-95

    [6]YingAn,Yoshikazu Adachi,Yasuki Ogawa.Classification of lactic acid bacteria isolated from chigee and mare milk collected in Inner Mongolia[J].Animal science journal,2004,75(3):245

    [7]李少英,烏尼.馬奶酒中乳酸菌的分離及其生物學(xué)特性的研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,23(4):27-29

    [8]Ishii S.Microbiol study of traditional fermented dairy products Haruhaand Buriatin Monologia[J].MilkScience,2001,50(1):25-29

    [9]Burentegusi,Taku Miyamoto,Shoji Nakamura,et al.Identification of lactic acid bacteria isolated from fermented mare’s milk“chigee”in Inner Mongolia,China[J].Anim Sci Technol,2002,73(3):441-448

    [10]熊素玉,姚新奎,譚小海,等.酸馬奶中乳酸菌的分離、純化與鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,44(5):696-701

    [11]孫天松,王俊國(guó),張列兵,等.中國(guó)新疆地區(qū)酸馬奶中乳酸菌生物多樣性研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2007,34(3):451-454

    [12]烏日娜,張和平,孟和畢力格.酸馬奶中乳桿菌Lb.casei Zhang和ZL12-1的16s DNA基因序列及聚類分析 [J].中國(guó)乳品工業(yè),2005,33(6):4-9

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