靈武長棗采后主要病原真菌的鑒定

任玉鋒，馬愛瑛，劉雅琴，韓培杰

（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

靈武長棗（Zizphus jujubamill cv.lingwuchangzao）是寧夏靈武有地方特色的優(yōu)良棗品種，其個大、色艷、果肉致密酥脆、酸甜適口，鮮棗含糖量高，VC含量達(dá)3 g/kg～4 g/kg，是集營養(yǎng)、保健于一體的優(yōu)質(zhì)果品，是寧夏優(yōu)勢特色水果之一。但靈武長棗與其他棗類一樣，在自然條件下貯藏比較困難，鮮銷期只有半個月左右，在貯藏中因真菌病害侵染而導(dǎo)致的腐爛率達(dá)30%～40%[1]，嚴(yán)重制約了寧夏紅棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。甘瑾等從貯藏的靈武長棗中分離并采用形態(tài)學(xué)的方法鑒定出了貯藏過程中引起腐爛病害的四種主要病原真菌[1]。本試驗(yàn)以靈武長棗為主要研究對象，分離和篩選出引起靈武長棗采后腐爛的主要致腐病原真菌，并用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法相結(jié)合對之進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步研究靈武長棗采后生理及保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS型）：上海申安醫(yī)療器械廠，上海；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS智能型）：寧波江南儀器廠，寧波；雙人單面潔凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司，蘇州；光學(xué)顯微鏡（CX31RTSF）：Olympus，日本，等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料

靈武長棗：產(chǎn)自寧夏靈武市靈河鎮(zhèn)二道溝村棗園；引物：由 TaKaRa公司合成；Tap酶、dNTP：均購自TaKaRa公司。

1.2 靈武長棗采后主要病原真菌的分離

參照甘瑾等的方法分離靈武長棗采后主要病原真菌[1]。

1.3 靈武長棗采后主要病原真菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)的鑒定

根據(jù)病害癥狀、菌落形態(tài)及菌絲、孢子、孢子器等的特征來確定病原菌的種屬。

1.3.2 靈武長棗主要病原真菌rDNA-ITS序列分析

1.3.2.1 總DNA的提取

參照莊得鳳等的CTAB方法提取菌株的總DNA[2]。

1.3.2.2 rDNA-ITS序列的擴(kuò)增

擴(kuò)增 ITS區(qū)（以 ITS1：5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’和 ITS4：5’-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3’為引物）的 rDNA 序列，反應(yīng)體系 50μL（5μL PCR buffer（10×PCR buffer），4μL dNTPs（2.5 mmol/L），1μL模板 DNA，上下游引物各 1μL，0.25μL Taq，加 ddH2O至50μL。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min后，30個循環(huán)包括 94℃50s，51℃50s、72℃2min，72℃延伸 10min。反應(yīng)完成后，-20℃保存?zhèn)溆茫?.8%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產(chǎn)物純化后直接測序（測序由大連寶生物公司完成）。將獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)共分離到4種典型菌株，分別記錄為A、B、C、D。

2.1 靈武長棗采后主要病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將從貯藏的靈武長棗果實(shí)上分離出A、B、C、D 4種病原真菌，挑取各菌落少許到載玻片上，制片并用顯微鏡觀察、測量、拍照，根據(jù)各病原菌的形態(tài)特征對其進(jìn)行鑒定。

2.1.1 病原菌A形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察

病原菌A形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察，見圖1。

由圖1的A1、A2、A3、A4可見，病原菌A菌落黑灰色；有發(fā)達(dá)的假根和匍匐枝，菌絲無隔，孢囊梗較長，自假根伸出單根而不分枝，末端突入孢囊內(nèi)與孢囊相接，1～10枝叢生于假根上；孢子囊為球形，孢囊孢子形狀不規(guī)則，孢子大小 10μm～20μm，依據(jù)文獻(xiàn)[1，3]初步鑒定為黑根霉（Rhizopus stolonifer），是長棗采后最嚴(yán)重的致病菌。

圖1 病原真菌A形態(tài)及培養(yǎng)性狀Fig.1 Form and culture character of pathogenic fungi A

2.1.2 病原菌B形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察

病原菌B形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察，見圖2。

圖2 病原真菌B形態(tài)及培養(yǎng)性狀Fig.2 Form and culture character of pathogenic fungi B

由圖2的B1、B2、B3、B4可見，病原菌B菌落墨綠色；菌絲有隔單核，分生孢子梗直立，頂端1至多次分枝呈掃帚狀，分枝上產(chǎn)生3輪不對稱的瓶狀小梗，其頂端著生成串的分生孢子，球形，呈念珠狀，一般5～20個成串相連，孢子直徑 2μm～3μm。依據(jù)文獻(xiàn)[1，3-4]初步鑒定為青霉屬（Penicillium sp.）的真菌。

2.1.3 病原菌C形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察

病原菌C形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察，見圖3。

由圖3的C1、C2、C3、C4可見，病原菌C菌落成圓形灰褐色，邊緣不規(guī)則白色；菌絲有隔；分生孢子梗叢生，分生孢子有倒棍棒形、卵形或橢圓形，常帶有短圓形喙，分生孢子一般有橫隔，少數(shù)有縱隔，孢子大小 30μm×10μm；依據(jù)文獻(xiàn) [1，3]初步鑒定為鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissl]。

圖3 病原真菌C形態(tài)及培養(yǎng)性狀Fig.3 Form and culture character of pathogenic fungi C

2.1.4 病原菌D形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察

病原菌D形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察，見圖4。

圖4 病原真菌D形態(tài)及培養(yǎng)性狀Fig.4 Form and culture character of pathogenic fungi D

由圖4的D1、D2、D3、D4可見，病原菌D菌落邊緣白色，有同心圈紋，表面有小水粒；菌絲有隔，分生孢子梗直立，不分枝，分生孢子1～2個頂生。分生孢子洋梨形，雙細(xì)胞分隔處略縊縮，孢子基部有一乳頭狀突起。被病原菌侵染的棗果初期為白色，后期變?yōu)榉奂t色，棗果表皮干燥。依據(jù)文獻(xiàn)[1，3]初步鑒定為粉紅聚端孢[Trichoderma roseum（Pers.）Link]。

2.2 靈武長棗采后主要病原真菌rDNA-ITS序列分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離得到的4種真菌的PCR反應(yīng)體系產(chǎn)物均為單一條帶，如圖5所示。

圖5 ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.5 了Amplification Electrophoretogram of ITS

PCR產(chǎn)物直接純化測序后，序列測定片段產(chǎn)度分別為：ITS序列PCR擴(kuò)增條帶大小約700 bp。把所得到序列提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST比較，A 的 ITS序列與 Rhizopus stolonifer（AM933544）同源性為100%、B的ITS序列與penicillium crustosum（HQ026728）同源性為99%、C的ITS序列與Alternaria alternata（GQ121322）同源性為 99%、D 的 ITS序列與Trichothecium roseum（HQ115655.1）同源性為99%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析法相結(jié)合的方法，從采后貯藏的靈武長棗中分離鑒定出4種主要病原真菌進(jìn)行鑒定。真菌rDNA序列分析用于真菌系統(tǒng)分類通常通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)實(shí)現(xiàn)。PCR技術(shù)在真菌分類與鑒定中有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如快速、靈敏、需樣品量少等。RENSKE等[5]認(rèn)為真菌通過rDNA-ITS區(qū)域比對，序列相似性大于99%，鑒別為同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬；序列相似性小于95%，鑒別為同科，因此結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，可以初步鑒定此4株病原真菌分別為：黑根霉（Rhizopus stolonifer）、皮落青霉（penicillium crustosum）、鏈格孢[Alternaria alternata（Fr.）Keissl]和粉紅聚端孢[Trichoderma roseum（Pers.）Link]，其中從貯藏的靈武長棗中分離出鏈格孢和粉紅聚端孢已有資料報道[1]，而黑根霉、皮落青霉為在靈武長棗中首次分離得到病原真菌。

[1]甘瑾,唐文林,潘祿,等.靈武長棗采后病原菌的分離及天然抗菌物質(zhì)的篩選[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,35(10):81-86

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