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    大豆蛋白凝膠顯微結(jié)構(gòu)研究

    2012-12-02 00:58:04于翠柳陳野李秀明郭立華張寧
    食品研究與開發(fā) 2012年9期
    關(guān)鍵詞:鹽鹵凝固劑戊二醛

    于翠柳,陳野,李秀明,郭立華,張寧

    (天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

    許多大豆食品的加工是利用大豆蛋白的凝膠化制作的,例如制作豆腐、酸乳酪等[1],大豆蛋白凝膠的形成與多種因素有關(guān),如大豆的化學(xué)性質(zhì)、豆?jié){中的固形物的含量[2]及凝固劑的濃度[3]等,許多科研人員研究了大豆蛋白凝膠的形成機(jī)理,李里特[4]等研究了豆腐的加工工藝以及鹽類凝固劑的凝固特性與作用機(jī)理,考察了基本的加工條件對豆腐凝膠強(qiáng)度的影響。大豆蛋白凝膠形成的實質(zhì)就是大豆蛋白在凝固劑的作用下相互結(jié)合,形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),將脂肪、水等成分包容在一起[5],這研究的是大豆蛋白凝膠的綜合特性。凝膠的形成有眾多的影響因素,為了減小脂肪、糖等成分對凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響,本實驗采用大豆分離蛋白作為原料來制備大豆蛋白凝膠,研究其凝膠形成特性。大豆蛋白凝膠的工藝以及工藝參數(shù)對凝膠質(zhì)構(gòu)影響的研究已經(jīng)很多,但這些條件對凝膠顯微結(jié)構(gòu)影響研究還不深入,本文采用鹽鹵、葡萄糖酸內(nèi)酯和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作為凝固劑制備大豆蛋白凝膠,采用戊二醛和乙醇作為固定劑來固定凝膠的結(jié)構(gòu),冷凍干燥后測定其硬度并觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

    1 材料和方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    大豆分離蛋白:平頂山植物蛋白有限公司。

    鹽鹵:天津利民調(diào)料有限公司;葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL):江蘇康力生物科技發(fā)展有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase):江蘇一鳴生物制品有限公司;戊二醛:天津博迪化工股份有限公司;乙醇:天津市江天化工技術(shù)有限公司(均為分析純)。

    1.1.2 儀器

    KDM型調(diào)溫電熱套:A型,山東省鄄城永興儀器廠;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市金城國勝實驗儀器廠;MODULYOD-230型冷凍干燥機(jī):美國熱電公司;TAXT plus型物性分析儀:北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司;SU1510型掃描電子顯微鏡:日本那珂事業(yè)所。

    1.2 方法

    1.2.1 大豆蛋白凝膠的制備

    配制質(zhì)量比為6%的生蛋白溶液,加熱至100℃并保持10 min,得到熟蛋白溶液。

    取300 mL熟蛋白溶液在500 mL的燒杯中,與不同濃度(質(zhì)量體積比分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)的鹽鹵混合3 min,將混合物迅速轉(zhuǎn)移到80℃的水浴鍋中保溫凝固30 min,制得鹽鹵處理的大豆蛋白凝膠,然后快速冷卻到20℃,最后儲放在4℃冷藏箱內(nèi)備用。

    另取30℃以下300 mL熟蛋白溶液在500 mL的燒杯中,與不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L)的葡萄糖酸內(nèi)酯混合3 min,其他的操作同鹽鹵,制得葡萄糖酸內(nèi)酯處理的大豆蛋白凝膠。

    取300 mL、50℃熟蛋白溶液倒入含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(10、20、30、40、50 kat/g)的燒杯中,將其置于 50 ℃的水浴鍋中3 h。制得轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的大豆蛋白凝膠。

    1.2.2 大豆蛋白凝膠的固定和干燥

    大豆蛋白凝膠切成長條(65 mm×15 mm×15 mm),在一定濃度的固定劑溶液(不同濃度的戊二醛或100%乙醇)中固定24 h。用pH7.2的磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次10min。用體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脫水,每種濃度的乙醇各處理10 min。經(jīng)脫水后,用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥。

    1.2.3 掃描電鏡觀察

    干燥后的凝膠置于液氮中脆斷,處理好后粘在金屬樣品臺上,斷裂面向上,采用離子濺射方法鍍金,鍍金的條件為15 kV、15 mA、1.5 min。然后將樣品置于掃描電子顯微鏡(15 kV)下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

    1.2.4 大豆蛋白凝膠硬度測定

    冷凍干燥后的大豆蛋白凝膠放在物性分析儀上做硬度實驗,采用A/WEG探頭(30°角精細(xì)鍥型刀具),測試速度為2.0 mm/s,凝膠硬度是指探頭切斷凝膠時所受到的最大的力,儀器讀數(shù)單位為g。每種凝膠測定5次。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 處理方法對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

    2.1.1 凝固劑對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

    表1表示的是選取任意不同的凝固劑處理的凝膠樣品單位面積(1μm2)內(nèi)網(wǎng)孔的個數(shù)以及直徑。

    表1 不同的凝固劑處理下的凝膠網(wǎng)絡(luò)中網(wǎng)孔的個數(shù)及直徑Table 1 Number and diameter of holes in the gel network treated by different coagulants

    從表1可以看出,隨著鹽鹵的加入,網(wǎng)孔的個數(shù)增多,這是因為鹽鹵中的高價陽離子與大豆蛋白表面帶負(fù)電荷的氨基酸殘基結(jié)合,從而使蛋白質(zhì)間的靜電斥力減弱,當(dāng)大豆蛋白溶液中的鹽離子達(dá)到凝固濃度時,蛋白質(zhì)之間的斥力和引力達(dá)到平衡,蛋白質(zhì)結(jié)合成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);0.7%鹽鹵形成凝膠的網(wǎng)孔的個數(shù)最多,孔徑有減小趨勢,孔徑均等于或小于1μm,其原因為:隨著鹽鹵濃度的進(jìn)一步增加,正離子對蛋白的靜電屏蔽作用增強(qiáng),使得大豆蛋白分子之間的斥力進(jìn)一步降低,引力增加,于是蛋白相互結(jié)合的速率加快,形成的網(wǎng)孔變多,孔徑略有減小。

    對于葡萄糖酸內(nèi)酯制備的凝膠樣品來說,隨著葡萄糖酸內(nèi)酯濃度的增加,網(wǎng)孔個數(shù)先增后減,0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯形成凝膠的孔的個數(shù)最多,孔徑呈減小趨勢,其原因為:當(dāng)加入葡萄糖酸內(nèi)酯后,葡萄糖酸內(nèi)酯逐漸水解產(chǎn)生H+,使蛋白質(zhì)分子所帶負(fù)電荷減小,分子間的靜電斥力減弱,當(dāng)葡萄糖酸內(nèi)酯的濃度達(dá)到一定程度時,在疏水相互作用等引力的作用下,蛋白分子逐漸結(jié)合到一起,形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。GDL濃度高于0.06 mol/L后,葡萄糖酸內(nèi)酯進(jìn)一步水解產(chǎn)生H+,大豆蛋白分子電荷量繼續(xù)減小,分子間的結(jié)合力相對來說加強(qiáng),蛋白分子相互結(jié)合的速率加快,容易堆扎在一起,孔的個數(shù)就會減少,孔徑也變小。

    此外,對于應(yīng)用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備的凝膠樣品來說,TGase濃度是40 kat/g時,網(wǎng)孔的數(shù)量最多,孔徑最小。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase,簡稱TGase,全稱是蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶)是一種能夠催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺基之間結(jié)合反應(yīng)的酶,蛋白或多肽之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物,其中蛋白質(zhì)(或多肽)交聯(lián)所產(chǎn)生的橋叫做ε-(γ-谷氨酰胺基)賴氨酸鍵(G-L鍵)[6]。Chanyongvorakul等[7]報道大豆蛋白在TGase的作用下,酸性亞基能夠交聯(lián)而被聚合。Sakamo[8]測定了TGase酶促反應(yīng)物ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸的含量,證明賴氨酸的含量隨著該酶濃度的升高而升高,這和本實驗中低酶濃度時的變化一致。TGase濃度升到50 kat/g時,凍干凝膠孔的個數(shù)迅速減少,孔徑也很小,說明維系蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定所需的共價鍵的數(shù)目具有一定的飽和性,過多的酶量反而不利于凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

    圖1是3種凝固劑處理的凝膠中網(wǎng)孔個數(shù)較多的凝膠樣品的SEM圖,圖1a是0.7%鹽鹵處理的凝膠的SEM圖,圖1b是0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的SEM圖,圖1c是40 kat/g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的凝膠的SEM圖。

    圖1 不同凝固劑處理的凝膠的顯微結(jié)構(gòu)(均由2.5%戊二醛固定)Fig.1 Microstructure of gels treated by different coagulants(all of gels were fixed by 2.5%glutaraldehyde)

    由圖1可見,采用2.5%戊二醛固定凝膠結(jié)構(gòu)的條件下,用3種凝固劑制備的大豆蛋白干凝膠的微觀結(jié)構(gòu)有很大的差異:鹽鹵處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較粗疏、網(wǎng)孔大小不均且分布不均(圖1a),葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密程度高、網(wǎng)孔較小且均勻(圖1b),轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與葡萄糖酸內(nèi)酯處理凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相似,但其孔徑更?。▓D1b孔徑為 0.3μm,圖 1c孔徑為 0.1μm)。

    2.1.2 固定劑對凝膠顯微結(jié)構(gòu)的影響

    為了真實反映大豆蛋白凝膠的結(jié)構(gòu),采用固定劑固定其結(jié)構(gòu)。常用的固定劑有乙醇、冰醋酸、甲醛、戊二醛等,戊二醛是蛋白質(zhì)的強(qiáng)固定劑,但由于其毒性,故本實驗采用了100%乙醇作為固定劑,與戊二醛固定凝膠的結(jié)構(gòu)做對比,以觀察乙醇的固定效果。

    圖2是由0.7%鹽鹵制備的大豆蛋白凝膠的SEM圖。

    圖2 不同固定劑處理的凝膠的顯微結(jié)構(gòu)(凝固劑均為0.7%鹽鹵)Fig.2 Microstructure of gels treated by different fixatives(coagulant of gels was 0.7%brine)

    由圖2可見,2.5%和6%戊二醛的固定效果相似,由此判斷,不同濃度的戊二醛對凝膠的顯微結(jié)構(gòu)無顯著影響;100%乙醇同樣能夠起到很好的固定效果,乙醇是一種極性有機(jī)溶劑,羥基中的H帶正電,O帶負(fù)電,可分別與大豆蛋白分子中的相反電荷作用,降低蛋白質(zhì)分子間的無序凝聚,有利于形成有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

    2.2 凝固劑和固定劑對凝膠硬度的影響

    凝膠強(qiáng)度是大豆蛋白凝膠的一個很重要的參數(shù),也反映出蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密程度,因此采用凝膠的硬度來反映其強(qiáng)度的大小。圖3是鹽鹵處理的凍干凝膠的硬度。

    圖3 鹽鹵和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.3 Effect of brine and fixatives on the hardness of the gel

    由圖3可見,同種固定劑固定的凝膠硬度隨著鹽鹵濃度的增加變化不大,不同的固定劑能對凝膠硬度產(chǎn)生顯著影響,100%乙醇固定的凝膠的硬度最大(約2500g),其次是6%戊二醛固定的凝膠硬度(約2000g),2.5%戊二醛固定的凝膠硬度最?。s1500 g)。100%乙醇固定的凝膠硬度最大,分析原因是:乙醇分子通過羥基OH和蛋白分子之間形成氫鍵,提高了大豆蛋白分子定向排列的有序性,因此用乙醇固定凝膠的硬度有顯著的提高。

    2.5%和6%的戊二醛對凍干后凝膠的硬度有顯著影響,故進(jìn)一步對中間濃度3.5%、4.5%、5.5%戊二醛處理的葡萄糖酸內(nèi)酯凝膠的硬度進(jìn)行檢測,觀察不同濃度的戊二醛處理的凝膠硬度是否有明顯區(qū)別。100%乙醇固定的葡萄糖酸內(nèi)酯凝膠凍干后碎成小塊,故無法進(jìn)行硬度測定。

    圖4 葡萄糖酸內(nèi)酯和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.4 Effect of GDL and fixatives on the hardness of the gels

    由圖4可見,葡萄糖酸內(nèi)酯濃度對凝膠硬度的影響不大,而不同濃度的戊二醛能對凝膠硬度產(chǎn)生明顯的影響,硬度隨著戊二醛濃度的增加而增大,2.5%戊二醛固定的凝膠硬度最?。s1000 g),6%戊二醛處理的凝膠硬度最大(約3500 g)。

    凝膠的顯微結(jié)構(gòu)直接影響著其物理特性,大豆蛋白凝膠不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了強(qiáng)度的變化。網(wǎng)孔越致密,強(qiáng)度越高。由表1分析得知0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠具有最致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),0.1 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠有最少的網(wǎng)孔和最小的孔徑,因此0.1mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯處理的凝膠的硬度是最大的。

    圖5 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和固定劑對凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of TGase and fixatives on the hardness of the gels

    圖5是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理的凝膠的硬度。隨著TGase酶量的增加,凍干凝膠的硬度逐漸增加,這說明形成的GL肽鍵在空間結(jié)構(gòu)上提高了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械性能,有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。6%戊二醛固定的凝膠硬度明顯高于2.5%戊二醛固定的凝膠硬度。

    3 結(jié)論

    通過對不同的凝固劑和固定劑作用下形成大豆蛋白凝膠顯微結(jié)構(gòu)和硬度的測試與觀察分析,結(jié)果表明:大豆蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要是由凝固劑決定的,由0.7%鹽鹵、0.06 mol/L葡萄糖酸內(nèi)酯、40 kat/g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備的凝膠有較多的網(wǎng)孔個數(shù);大豆蛋白凝膠的硬度與凝固劑和固定劑的濃度有關(guān),其中固定劑對凝膠硬度的影響顯著,100%乙醇固定的凝膠的硬度最大,其次是6%戊二醛固定的凝膠的硬度。

    以上數(shù)據(jù)為大豆蛋白凝膠制備的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參考,也為大豆蛋白凝膠在組織工程支架材料方面的應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。另外,通過研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在凝膠形成中的作用機(jī)理,發(fā)現(xiàn)該酶適合于制備大豆蛋白凝膠,這將是大豆蛋白凝膠方面新的研究方向。

    [1]陳復(fù)生,李里特.大豆蛋白凝膠光學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2002:3

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