葛根素對高糖誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細胞細胞因子及鈣離子的影響

張 玲，許 薇，孫 媛，高俊虹

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001;2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001;3.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700)

糖尿病性心臟病(diabetic cardiomyopathy，DC)是糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥之一。近年來，心肌細胞因子和鈣離子在心血管疾病發(fā)病中的重要作用已日益受到重視。葛根素(Puerarin，Pue)為豆科植物野葛干燥根中的提取物。已有動物實驗表明，Pue在心血管方面有調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)、血漿內(nèi)皮素(endothelin，ET)和一氧化氮(nitric oxide，NO)含量［1］，拮抗 β-腎上腺受體［2］，降低心肌細胞鈣離子濃度［3］等多方面作用。但因整體動物實驗影響的因素較多，且是否對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞有影響少見報道。本實驗用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞研究Pue對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞 NO、ET和鈣離子的影響，為進一步Pue在DC方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品與試劑

出生2d～3d的SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供(動物許可證號 SCXK(遼)2007-2011)。Fura-2、HEPES、低 糖 培 養(yǎng) 基DMEM、胰蛋白酶、MTT試劑均購自美國 Sigma公司;NO試劑盒購自南京建成生物工程公司;ET試劑盒購自北京放免技術(shù)研究所;Pue購自廣東燕塘生物化學(xué)藥業(yè)有限公司;小牛血清為杭州四季青生物材料研究所產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。

1.2 大鼠乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)

取出生2d～3d的 SD大鼠乳鼠，雌雄不拘，引頸法處死動物。無菌條件下用75%乙醇消毒皮膚，開胸剪取心臟，放入盛有無血清培養(yǎng)液的冰冷容器，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次后，剪成1mm3大小的碎塊，加入0.6 g/L胰蛋白酶消化細胞。將消化完畢的細胞置入含有體積分數(shù)分別為0.15的小牛血清、0.84的 DMEM培養(yǎng)基及0.01的雙抗液(含100KU/L青霉素，100mg/L鏈霉素)的培養(yǎng)基。將細胞懸液吹打均勻，以1×108/L的密度接種于24孔培養(yǎng)板，送入5%CO2及95%空氣的 CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 分組及給藥方法

常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞2d～3d后，更換含0.4%小牛血清的培養(yǎng)基，以減少血清成分對實驗結(jié)果的影響。設(shè)不給藥組為空白對照組，其他組分別給藥:給予 25mmol/L 高糖(highglucose，HG)組、HG+10－3mol/L Pue組 (Pue先孵育30min)、25mmol/L HG+2×l0－3mol/L Pue組(Pue先孵育 30min)。繼續(xù)培養(yǎng)2d～3d后進行各項指標的測定。

1.4 MTT法測定心肌細胞的存活率

取1.3中經(jīng)各藥物處理48h的細胞接種于96孔板中，加入 MTT(5 g/L)20μL，置 37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后去除培養(yǎng)基后，加入150μl DMSO溶解結(jié)晶體，輕輕晃動15min～20min后，酶標儀在波長為490 nm處測定吸光度(A)值，用此計算細胞的存活率。

1.5 NO和ET濃度的測定

取細胞培養(yǎng)液，10000r/min，離心 10min取上清，硝酸還原酶法檢測各組NO濃度，放免法測定各組ET-1含量。

1.6 Ca2+的測定

將有自發(fā)性搏動的心肌細胞從培養(yǎng)板中取出，置于含有 Fura-2/AM(3μmol/L)的 DMEM培養(yǎng)基中，其中含有白蛋白0.2%，在37℃水浴中孵育30 min，用HEPES緩沖液沖洗后，放于熒光顯微鏡下的灌流槽中，恒溫37℃，用 HEPES緩沖液沖洗灌流，灌流速度為1mL/min，所有藥物均在指定時間加入灌流液中。所用的測定儀器為Till陽離子測定系統(tǒng)(德國)采用 DM3000軟件，激發(fā)光波長分別為340 nm及380 nm，發(fā)射光波長為505 nm，采樣間隙為300ms。每次選取10個細胞，測量心肌細胞［Ca2+］i的瞬間變化，連續(xù)記錄心肌細胞在給藥前后的熒光強度。根據(jù)文獻［4］方法計算心肌細胞［Ca2+］i，計算［Ca2+］i前應(yīng)減去細胞自身的熒光。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，2組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析。以 P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有非常顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Pue對心肌細胞存活率的影響

表1顯示，與空白組相比，HG組的細胞存活率降低了36.6%，差異極顯著(P＜0.01);與高糖組相比，HG+10－3mol/L Pue組和 HG+2 × l0－3mol/L Pue組分別增加了46.2%和53.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 Pue對心肌細胞NO和 ET的影響

表2顯示，HG組細胞的NO水平較對照組降低38.24%，ET水平則升高27.4%，差異極顯著(P＜0.01);Pue 2個治療組較 HG組的2項指標有顯著性改善，其中 2×l0－3mol/LPue組效果更好，與HG組的差異也最顯著(P＜0.01)。

表1 Pue對HG誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細胞存活率的影響(±s)

表1 Pue對HG誘導(dǎo)的乳大鼠心肌細胞存活率的影響(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別A570 0.82 ±0.03 HG(2 5 mmol/L)組 0.52 ±0.02＊＊HG +1 0 －3mol/LPue 組 0.77 ±0.03△HG+2 × l0－3mol/LPue組 0.80 ±0.02空白組△△

表2 Pue對HG誘導(dǎo)心肌細胞NO和ET的影響(±s)

表2 Pue對HG誘導(dǎo)心肌細胞NO和ET的影響(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別 NO(μmol/L)ET(μmol/L)68.35 ±9.35 4.83 ±0.64 HG(2 5 mmol/L)組 42.21 ±7.34＊＊ 6.15 ±0.86＊＊HG +1 0－3mol/LPue 組 59.84 ±8.66△ 5.24 ±0.72△HG+2 × l0－3mol/LPue組 64.62±7.51△△ 4.98±0.61空白組△△

2.3 Pue對心肌細胞Ca2+的影響

表3顯示，HG組心肌細胞［Ca2+］i變化的基線水平與空白組接近，但［Ca2+］i瞬間變化幅度明顯增高，頻率顯著性加快(P＜0.01)。Pue 2個劑量組均能降低顯著性HG誘導(dǎo)的心肌細胞鈣離子瞬間變化，其中在變化幅度上2×l0－3mol/LPue組改善效果更好。

表3 Pue對HG誘導(dǎo)心肌細胞［Ca2+］i瞬間變化的影響(±s)

表3 Pue對HG誘導(dǎo)心肌細胞［Ca2+］i瞬間變化的影響(±s)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0.01;與模型組比較:△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別 ［Ca2+］i/nmol·L －1 f/min峰值 靜息182±12 102±8 48±3.1 HG(2 5 mmol/L)組 298±14＊＊ 103±8 76±4.5＊＊HG+1 0－3mol/LPue組 244±13△ 104±6 52±3.6△△HG+2×l0－3mol/LPue組 194±12△△ 103±7 51±2.9空白組△△

3 討論

ET是一種很強的縮血管活性肽，由心肌細胞和成纖維細胞合成并分泌。體內(nèi)外研究表明，ET既可以促進心肌細胞和血管平滑肌合成釋放AngⅡ，又是醛固酮合成和釋放的強效調(diào)節(jié)劑。ET及其受體的表達也與糖尿病大鼠心肌纖維化有關(guān)，高血糖可引起內(nèi)皮素受體上調(diào)，應(yīng)用ET受體拮抗劑可對抗高糖下心肌缺血再灌注引起的心肌細胞損傷［5］。NO是內(nèi)皮細胞合成和分泌的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，它有許多血管生理調(diào)節(jié)功能，如舒張血管、降低血壓;維持血管內(nèi)膜表面無血栓形成，抑制血管平滑肌細胞增殖，維持其正常的有絲分裂;維持正常的心肌收縮功能及心輸出量等。有報道顯示［6、7］，高糖可引起內(nèi)皮細胞NO合成減少，血液中NO濃度降低，血管平滑肌NO/cGMP通路反應(yīng)異常。

本實驗結(jié)果顯示，在低血清培養(yǎng)環(huán)境下，HG會使培養(yǎng)心肌細胞存活率和NO濃度下降，ET水平增加;應(yīng)用Pue干預(yù)的2組可以使高糖環(huán)境的心肌細胞在上述指標方面產(chǎn)生明顯改善，即細胞存活率和NO含量較 HG升高，ET水平下降，且2×10－3mol/LPue組效果更好。這說明Pue可以通過影響心肌細胞相關(guān)因子水平抑制高糖產(chǎn)生的不良影響。

Ca2+是心肌細胞最重要的信號分子之一，生理狀態(tài)下主要參與心肌細胞的機械做功和能量代謝。大量實驗表明，Ca2+作為一個細胞信號傳導(dǎo)過程中的主要信使，介導(dǎo)了糖尿病心肌肥大的形成和發(fā)展［8、9］。心肌細胞內(nèi) Ca2+超載是糖尿病性心肌病的發(fā)病原因之一。ET可增加心肌細胞和成纖維細胞的有絲分裂，直接引起心肌細胞鈣超載［10］。李菊香研究發(fā)現(xiàn)，Pue能抑制外源性氧化型低密度脂蛋白培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一氧化氮合酶(NOS)抑制物，使NO合成增加，ET減少，細胞內(nèi)［Ca2+］i下降，從而改善內(nèi)皮細胞功能［11］。本次實驗結(jié)果可見，HG組與空白組相比心肌細胞鈣離子的峰幅度顯著升高(P＜0.01)，頻率明顯加快(P＜0.01);Pue 2個治療組可以顯著改善高糖環(huán)境心肌細胞的上述指標，而且結(jié)果仍提示2×l0－3mol/LPue組的效果更好。

綜上所述，本實驗證實Pue能夠有效地干預(yù)高糖誘導(dǎo)的心肌細胞因子的改變和鈣超載，提示這可能是葛根素抑制高糖誘導(dǎo)心肌細胞損傷發(fā)生的保護機制之一。

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