聯(lián)合檢測血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達對乳腺癌早期微轉(zhuǎn)移的診斷價值

張 瓊* 譚小軍 高蔚櫻

（廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510095）

乳腺癌是一類嚴(yán)重危害婦女健康的主要惡性腫瘤。引起乳腺癌患者死亡最主要原因是遠(yuǎn)處播散、轉(zhuǎn)移。瘤細(xì)胞進入外周血中的微轉(zhuǎn)移是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必需步驟本研究利用熒光定量PCR技術(shù)，以人乳腺珠蛋白（hMAM）、細(xì)胞角蛋白19（CK19）、癌胚抗原（CEA）、乳腺上皮黏蛋白（SBEM）作為標(biāo)志，檢測乳腺癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并初步探討其在微轉(zhuǎn)移檢測中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月至2011年12月我院治療的乳腺癌患者外周血標(biāo)本100例。乳腺纖維腺瘤患者血標(biāo)本70例及健康志愿者血標(biāo)本l0例作為對照。所有患者均術(shù)前采血，術(shù)前均未經(jīng)化療、放療等任何治療。

表1 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達聯(lián)合檢測結(jié)果

1.2 主要試劑、儀器

抽提總RNA的Trizol試劑購自Gibco BRL公司，SYBR Premix Ex Tag（Perfect Real Time）購自Takara公司，Lightcycler PCR熱循環(huán)儀購自Roche公司。hMAM上游引物5'-CCGACAGCAGCAGCCTC AC-3',下游引物5'-TCCGTAGTTGGTTTCTC AC-3'；CK19上游引物5'-CTGAGTGACATGCGAAGCCAATA-3',下游引物5'-ATCTTCCTGTC CCTCGAGCA-3'；CEA上游引物5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAGGAAGAAGC-3',下游引物5'-GGGCCACTGTGGGCATCATGA TTGG-3'；SBEM上游引物5'-CTGCCCAGAATCCGACAACAG-3',下游引物5'-AGCAGTGGTCGCAGTGGTTGC-3'；β-actin上游引物5'-TTGCCGACAGGATGCAG AAGGA-3',下游引物5'-AGGTGGACAG CGAGGCCAGGAT-3'。以上引物均由Primer 5軟件設(shè)計，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取

取靜脈血5mL（棄去開始的1 mL，以防上皮細(xì)胞的污染），EDTA （1mg/mL）抗凝，生理鹽水稀釋2～3倍，用淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA用于檢測。

1.3.2 熒光定量PCR檢測

按照SYBR Premix Ex Tag試劑盒說明。反應(yīng)體系20μL，包括cDNA模板2μL（陰性對照以蒸餾水代替），上下游引物各0.4μL，SYBR Premix Ex TaqTM染料10μL。在Lightcycler PCR熱循環(huán)儀上進行擴增和分析，擴增參數(shù)為： 50℃ 2min，95℃ 10min后;再94℃ 15 min，66℃ 1min，40次循環(huán)。

1.4 結(jié)果計算

表達量計算方法根據(jù)比較閾值法推導(dǎo)出目的基因的量= 2-△△Ct（cycle of threshold.Ct）。＞2判為陽性[1]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達

乳腺癌組外周血hMAM、CK19、CEA和SBEM mRNA的陽性表達率分別為43%、36%、31%和46%；而乳腺纖維腺瘤患者CK19 mRNA的陽性表達率為8.10%，CEA mRNA的陽性表達率為2.86%，hMAM和SBEM未檢出；健康志愿者外周血中均未檢出。這4種標(biāo)志物在乳腺癌患者外周血中的陽性表達率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達聯(lián)合檢測對乳腺癌微轉(zhuǎn)移的診斷價值

單項檢測敏感度為31%一46%，4項聯(lián)合檢測對乳腺癌診斷的敏感度及準(zhǔn)確性明顯升高（表1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），特異性改變無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞進入外周血中的微轉(zhuǎn)移是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提。以往研究多為探討單個微轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的作用，但乳腺癌的微轉(zhuǎn)移是一種多基因、多階段、多因素作用的結(jié)果，單一的一種診斷指標(biāo)往往不夠。綜合應(yīng)用多個指標(biāo)通?？梢詮浹a單一指標(biāo)的敏感性或特異性不高的缺點，有效地提高其診斷準(zhǔn)確率。

研究證實[2]hMAM mRNA的表達僅限于成人的乳腺組織和乳腺癌細(xì)胞株，在乳腺癌原發(fā)灶中的表達明顯高于正常乳腺組織，在正常淋巴結(jié)或外周血白細(xì)胞檢測不到hMAM mRNA的表達，可用于乳腺癌微轉(zhuǎn)移的檢測[3]。CK19表達于正常上皮及上皮源性原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞，而血細(xì)胞無CKl9表達的細(xì)胞，可作為檢測循環(huán)癌細(xì)胞指標(biāo)[4,5]。CEA過表達于消化道腫瘤、乳腺癌等腫瘤中，血清CEA水平與乳腺癌患者的導(dǎo)管受累情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)和腫瘤分期有關(guān)[6,7]。SBEM是一種新的用于檢測乳腺癌微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物[8]，僅在乳腺和唾液腺中表達，常常高表達于陽性淋巴結(jié)。

本研究資料顯示，乳腺癌患者外周血中hMAM、CK19、CEA和SBEM mRNA陽性表達率均明顯高于對照組，表明4種標(biāo)志物對于檢測乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有較高的特異性。本研究中，單項指標(biāo)對乳腺癌微轉(zhuǎn)移診斷的敏感度均較低，而4種標(biāo)志物聯(lián)合檢測對乳腺癌微轉(zhuǎn)移診斷的敏感度及準(zhǔn)確性明顯升高，同時又保持了較高的特異性，提示聯(lián)合檢測hMAM、CK19、CEA和SBEM可有效避免單一指標(biāo)造成的遺漏，提高對乳腺癌微轉(zhuǎn)移的診斷正確率，因此可以作為一種檢測外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的有效方法，有助于指導(dǎo)臨床合理用藥、判斷預(yù)后，是提高患者生存率的關(guān)鍵。

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