HPA軸抑制大鼠感染性休克模型的建立及四逆湯對該模型的作用*

代 蓉，董柳慧，石安華，淤澤溥

(云南中醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，云南昆明 650500)

近年來，雖然抗感染治療和器官功能支持技術(shù)取得了長足的進步，但嚴重感染的病死率仍高達30% ～50%［1-2］。臨床流行病學資料顯示，感染性休克是危重病患者的主要死亡原因之一，現(xiàn)已成為進一步提高危重癥救治成功率的最大障礙［3］。針對嚴重感染和感染性休克的發(fā)生率和病死率均居高不下，提高對該癥的認識、探索有效的治療方法和藥物，無疑具有重要的理論價值及臨床意義。

四逆湯是《傷寒論》中回陽救逆的著名方劑，厥陰病之表熱里寒、下利、大汗、手足厥冷等，均可使用四逆湯治療［4-5］。多項臨床及藥理研究亦表明，四逆湯對多種休克具有一定的治療作用，但以往開展的與其作用機制相關(guān)的藥理研究主要集中于強心和改善微循環(huán)等方面展開，尚不能很好解釋其回陽救逆功效的科學內(nèi)涵。

近年來的研究認為HPA軸作為膿毒癥時神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的調(diào)控途徑，休克時HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)機制受損，可導致內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，表現(xiàn)為相對性腎上腺皮質(zhì)功能不全 (RAI)，調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)的功能狀態(tài)可能是感染性休克治療的新途徑。本研究從復制HPA軸抑制動物模型入手，在HPA軸抑制動物模型復制成功的基礎上，再注射內(nèi)毒素，進一步復制成HPA軸抑制大鼠感染性休克模型。探討四逆湯對該模型HPA軸的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量 (250±20)g，雄性。購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，動物合格證號:SCXK(川)2009-16。實驗前動物先適應性飼養(yǎng)1周，給予標準普通飼料和充分的飲用水，均為自由進食、自由飲水。飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學院實驗動物室。

1.2 藥品和試劑

四逆湯所用藥材炙甘草、干姜購于昆明市中醫(yī)院，附子購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，地塞米松 (DEX)，天津金耀氨基酸有限公司，批號:0901132;皮質(zhì)酮，購于 INTERNATIONAL LABORATORY USA公司;批號349610;脂多糖 0111:B4，購于 sigma公司，批號:029K4022。

ACTH試劑盒，購于北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號:20100225;CORT試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，批號:EPE0576R。

1.3 實驗用藥的制備

采用《傷寒論》中四逆湯原始組方，按漢代劑量單位換算，四逆湯方為:炙甘草31.2g，干姜23.4g，附子15g。實驗用方藥的制備按文獻［6-9］所記載方法進行，藥液濃縮成稠浸膏分裝置于冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要儀器

酶標儀:Molecular Device Corporation型號為340PC;放免儀:自動放免儀，中國科大中佳公司;RM6280型多道生理信號采集處理系統(tǒng):成都儀器廠。

2 方法和結(jié)果

2.1 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠的影響

［10-11］方法，雄性清潔級SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250g，隨機分為正常組、模型組、四逆湯高、低劑量組，每組20只。(1)正常組:每天1次皮下注射等體積橄欖油，連續(xù)14d;(2)四逆湯高、低劑量組:低劑量為人用量的等效劑量，即6.25g/kg;高劑量為人用量的6倍量，即37.5g/kg。每天1次灌胃四逆湯，直至實驗結(jié)束。第4天開始，在每天灌胃給藥的同時，同模型組方法造模;(3)模型組:按10mg/kg體質(zhì)量皮下注射皮質(zhì)酮 (Corticosterone，CORT)，每天1次，連續(xù)14d。各組動物自由攝食攝水。實驗第18天，各組大鼠水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，37℃水浴放置1h，3 000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液，-40℃保存待測。造模后，隔天記錄各組大鼠體質(zhì)量;參照文獻方法［10-11］酶聯(lián)免疫法測定各組大鼠血清CORT含量、放射免疫法測定大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素 (AdrenoCorticoTropic Hormone，ACTH)含量;取各組大鼠腎上腺，計算腎上腺指數(shù) (腎上腺指數(shù)=左右腎上腺質(zhì)量之和mg/大鼠體質(zhì)量g);取各組大鼠腎上腺，做病理組織學觀察。實驗結(jié)果見表1、表2:

表1 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠CORT、ACTH含量的影響 (x±s，n=20)

由表1可知，模型組CORT、ACTH含量比正常組降低 (P＜0.05)，表明HPA軸抑制，CORT、ACTH分泌減少;與模型組相比，四逆湯高劑量組大鼠血清CORT、ACTH含量升高 (P＜0.05、P＜0.01)，四逆湯低劑量組大鼠血清CORT含量也顯著升高 (P＜0.01)，提示四逆湯能夠?qū)笻PA軸抑制狀態(tài)。

表2 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠腎上腺指數(shù)的影響 (x±s，n=20)

由表2可見，模型組與正常組腎上腺指數(shù)比較，腎上腺指數(shù)明顯減輕 (P＜0.01)，提示長時間外源性給予皮質(zhì)酮，能使腎上腺萎縮;四逆湯高劑量組與模型組腎上腺指數(shù)比較，腎上腺指數(shù)增加(P＜0.05)，提示四逆湯高劑量能減輕皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠腎上腺萎縮。

2.2 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠感染性休克模型的影響

參考文獻［10，12-13］，清潔級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量250～270g。隨機分為7組:即正常組、模型組、陽性組、四逆湯預防給藥高、低劑量組、四逆湯治療給藥高、低劑量組，每組10只。(1)正常組:每天1次皮下注射等體積橄欖油，連續(xù)14d;(2)四逆湯預防給藥高、低劑量組:高低劑量的設置同前，每天1次灌胃四逆湯，直至實驗結(jié)束。第4天開始，在每天灌胃給藥的同時，同模型組方法造模;(3)模型組、陽性組、四逆湯治療給藥高、低劑量組:按10mg/kg體質(zhì)量皮下注射皮質(zhì)酮，每天1次，連續(xù)14d。各組動物自由攝食攝水。實驗第18天，四逆湯預防給藥高、低劑量組動物灌胃四逆湯1次，2h后各組大鼠水合氯醛麻醉，動物仰位固定在手術(shù)臺上，分離左側(cè)頸總動脈，取一內(nèi)充0.3%肝素生理鹽水的聚乙烯導管，插入左頸總動脈，此動脈導管與壓力換能器相連。用RM6280C型多道生理記錄儀記錄動脈血壓。穩(wěn)定半小時，記錄基礎血壓，各組動物腹腔注射LPS(4mg/kg)。注射 LPS后，陽性組腹腔注射DEX(5mg/kg)1次，四逆湯治療組灌胃四逆湯1次 (1mL/100g)。記錄注射LPS后3h血壓。參考文獻［12-13］標準，若平均動脈壓下降幅度超過基礎血壓值的20%，且持續(xù)20min以上，可認為實驗性感染性休克模型成功建立。記錄注射LPS前基礎血壓，及注射LPS后3h血壓值。結(jié)果見表3。

表3 四逆湯對HPA軸抑制感染性休克模型大鼠平均動脈壓的影響 ±s，n=10)

表3 四逆湯對HPA軸抑制感染性休克模型大鼠平均動脈壓的影響 ±s，n=10)

注:與正常組比＊＊P＜0.01;與模型組比△△P＜0.01;與治療高劑量比#P＜0.05

92.10±17.53 67.65±15.22 26.87±4.88模型組 87.85±35.52 60.28±28.33 34.79±11.69＊＊DEX組 5mg/kg 93.10±16.79 71.15±11.34 22.99±9.60△△預防高劑量組 37.5g/kg 100.01±40.60 83.40±30.06 14.91±5.05△△預防低劑量組 6.25g/kg 76.50±18.36# 60.70±16.12 20.90±5.74△△治療高劑量組 37.5g/kg 105.23±32.23 92.54±26.80 11.71±1.31△△治療低劑量組 6.25g/kg 101.53±19.27 86.02±8.80 14.08±6.89 100正常組組別 劑量 給LPS前血壓/mmHg A給LPS后血壓/mmHg B血壓下降率/%(A-B)/A*△△

由表3可知，模型組動物注射LPS后，平均動脈壓下降率超過20%，且下降率高于正常組 (P＜0.01)，可認為感染性休克模型復制成功。四逆湯預防組及治療組平均動脈壓下降率均低于模型組(P＜0.01)，提示四逆湯對感染性休克大鼠有一定的保護作用。

2.3 病理組織學檢查

2.3.1 組織蠟塊制備及HE染色

前一實驗中留取的腎上腺標本取材后置于10%甲醛溶液中固定24h后取出，水沖洗30min，梯度酒精脫水，浸蠟3h，即制成蠟塊。切成4μm厚的切片烤干備用。將烤干備用的切片置于60℃烤箱烤熱后于100%二甲苯中脫蠟25min;梯度酒精和蒸餾水水化后蘇木精染色5～15min，溫水沖洗5min藍化，鹽酸酒精分化，伊紅復染5～20s;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.3.2 結(jié)果

各組大鼠腎上腺病理切片觀察，見圖1～圖8。

2.4 統(tǒng)計學處理

以上實驗結(jié)果，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù) (x)±標準差 (s)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)進行方差分析;計量資料不符合正態(tài)分布，則用秩和檢驗;計數(shù)資料數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，或者用Fisher精確概率法;等級資料用秩和檢驗。

3 討論

近年來對中藥四性的基礎研究表明，溫熱藥有增強HPA軸的作用。沈自尹院士在對腎本質(zhì)的研究中證實:腎陽虛的病理改變主要在下丘腦，溫補腎陽的藥物可直接作用于下丘腦，提高促CRH的表達水平，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸的受抑狀態(tài)。基于四逆湯所主治病癥與感染性休克之間的相似之處及其在臨床上所表現(xiàn)出的抗休克作用，溫熱藥對HPA軸受抑制模型大鼠的腎上腺皮質(zhì)軸的異常變化具有良好的糾正作用和我們前期實驗結(jié)果，我們認為:四逆湯主要通過改善于感染性休克時受抑制的HPA軸功能而發(fā)揮抗休克作用。本研究通過復制了HPA軸抑制動物模型和HPA軸抑制大鼠感染性休克模型，考察四逆湯對該模型HPA軸的影響。

正常情況下，CORT分泌的增加是ACTH刺激的結(jié)果，在皮質(zhì)酮所致HPA軸抑制的狀態(tài)下，血中較高水平的皮質(zhì)酮可對ACTH的分泌產(chǎn)生負反饋抑制，導致 ACTH分泌減少，模型組 CORT、ACTH含量比正常組降低 (P＜0.05)，CORT、ACTH分泌減少，說明大鼠HPA軸抑制，皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型復制成功。給予高低劑量的四逆湯后，能夠?qū)笻PA軸的抑制狀態(tài)，高劑量組大鼠血清CORT、ACTH含量均升高，低劑量組大鼠血清CORT含量也顯著升高，ACTH雖也有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義。四逆湯改善HPA軸抑制狀態(tài)的機理還有待進一步研究。

圖1、圖2正常組腎上腺，HE染色，10×40，被膜由薄層結(jié)締組織構(gòu)成，無皺縮。球狀帶細胞較小，錐形，細胞聚集成球團狀。束狀帶細胞較大，多邊形，胞質(zhì)內(nèi)含脂滴空泡。

圖3、圖4皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型組腎上腺，HE染色，10×40，被膜皺縮，球狀帶細胞、束狀帶細胞體積縮小、數(shù)目減少，胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡增多。

圖5 高劑量組腎上腺

圖5、圖6四逆湯預防給藥高劑量組對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型腎上腺的影響，HE染色，10×40，被膜皺縮、球狀帶細胞、束狀帶細胞體積縮小、數(shù)目減少、胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡增多的現(xiàn)象較模型組減輕。

圖7、圖8四逆湯預防給藥低劑量組對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型腎上腺的影響，HE染色，10×40，被膜皺縮、球狀帶細胞、束狀帶細胞體積縮小、數(shù)目減少、胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡增多的現(xiàn)象較模型組減輕。

實驗中模型組腎上腺指數(shù)在皮質(zhì)酮造模之后降低，提示長時間給予外源性糖皮質(zhì)激素使腎上腺萎縮;文獻報道［10］皮質(zhì)酮應用能誘導大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞的大量調(diào)亡，減少球狀帶細胞的增殖和遷移，束狀帶和網(wǎng)狀帶細胞體積變小，皮質(zhì)酮造成腎上腺皮質(zhì)萎縮可能與上述因素均有關(guān)系。四逆湯高劑量組與正常組腎上腺指數(shù)比較，減少不明顯，并明顯高于模型組，提示四逆湯高劑量能減輕皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠腎上腺萎縮。四逆湯低劑量組腎上腺指數(shù)也高于模型組，雖然統(tǒng)計學上差異無顯著性意義，但出表現(xiàn)出減輕腎上腺萎縮的趨勢。組織病理學結(jié)果 (圖1～圖8)也表明:四逆湯高、低劑量組能改善腎上腺被膜皺縮狀態(tài)，使球狀帶細胞、束狀帶細胞體積較模型組增大、數(shù)目增加。由上可見，四逆湯可從多方面干預皮質(zhì)酮對腎上腺皮質(zhì)的損害或抑制，表現(xiàn)出對抗皮質(zhì)酮所致的大鼠HPA軸抑制。

在皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型復制成功的基礎上，給動物腹腔注射LPS復制HPA軸抑制大鼠感染性休克模型，為全面了解四逆湯的作用，增加了四逆湯預防給藥組。結(jié)果，四逆湯預防組及治療組平均動脈壓下降率均少于模型組 (P＜0.01)，提示四逆湯對感染性休克大鼠有一定的保護作用。文獻研究報道，四逆湯能顯著改善內(nèi)毒素性休克大鼠的微循環(huán)、抑制平均動脈壓的降低［14］。四逆湯能改善血壓、保持心率、減輕內(nèi)毒素引起的血液濃縮、抑制中性粒細胞數(shù)增加的作用，并在不同程度上提高內(nèi)毒素處理動物的存活率［15］。結(jié)合文獻報道和本實驗結(jié)果，我們認為四逆湯治療感染性休克時，其作用靶點可能是在HPA軸。本實驗用藥是以炙甘草為君藥的四逆湯，炙甘草用量較大，可以作為外源性糖皮質(zhì)激素補充在感染性休克時HPA軸抑制所致的糖皮質(zhì)激素相對不足。

本研究結(jié)果表明:四逆湯在感染中毒性休克伴腎上腺皮質(zhì)功能不全時能糾正HPA軸的抑制狀態(tài)，維持大鼠在應激狀態(tài)下器官功能、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而對調(diào)節(jié)危重癥應激反應和休克狀態(tài)起重要治療作用。

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