多指標正交試驗優(yōu)選雙花解毒顆粒中水提部分提取工藝

★ 丁志軍 廖銀根 羅美蘭 譚志江 (江西省皮膚病?？漆t(yī)院 南昌330001)

多指標正交試驗優(yōu)選雙花解毒顆粒中水提部分提取工藝

★ 丁志軍*廖銀根 羅美蘭 譚志江 (江西省皮膚病專科醫(yī)院 南昌330001)

目的:優(yōu)選雙花解毒顆粒水提部分提取工藝。方法:采用正交試驗設(shè)計，以綠原酸、芍藥苷含量及干膏率為指標，選取L9(34)正交表，優(yōu)化提取工藝中加水量、煎煮次數(shù)、煎煮時間3個因素。結(jié)果:以飲片投料，加12倍量的水煎煮2次，第一次1．5 h，第二次1．0 h為最佳工藝。結(jié)論:該工藝穩(wěn)定可靠，可用于生產(chǎn)。

雙花解毒顆粒;正交試驗;綜合評分法;高效液相色譜法

雙花解毒顆粒系江西省皮膚病專科醫(yī)院中醫(yī)科專家經(jīng)十幾年臨床總結(jié)，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)(專利號:ZL200410033920．X)的經(jīng)驗方。其由金銀花、連翹、菊花、赤芍等八味中藥組成，具有清熱解毒，祛瘀排膿的功效。臨床上主要用于治療由風、熱、濕毒所致的痤瘡、面部接觸性皮炎等皮膚病。為了將雙花解毒湯劑更好地應用于臨床上，江西省皮膚病?？漆t(yī)院根據(jù)其有效成分的性質(zhì)和藥理作用，將處方中藥物分為水提組和醇提組分別提取，研究開發(fā)出服用、攜帶方便的雙花解毒顆粒劑?，F(xiàn)就其水提組工藝研究報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司);CP225D微量天平(德國Sartorius);KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

綠原酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413);芍藥苷(中國藥品生物制品檢定所，批號110736-200833)。甲醇為色譜純，其余所有試劑均為分析純。本試驗中所用的藥材均由安徽亳州提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 考察指標的確定

雙花解毒顆粒處方中有多味中藥，有效成分眾多，因此以干膏率作為考察指標之一較全面合理;同時選取君藥金銀花、臣藥菊花都含的有效成分綠原酸，另一臣藥赤芍中有效成分芍藥苷含量作為考察指標，符合中藥多靶點，多方位的原則［1－2］。

2．2 考察指標的測定方法

2．2．1 干膏率的測定方法 精密移取正交試驗提取濃縮液50 ml，平行3份，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，并于105℃干燥3 h，迅速取出，置于干燥器中放置30 min，迅速精密稱定干膏重量。干膏率(%)=干膏重(mg)×濃縮液總量(ml)/取樣量(ml)/生藥總量(mg)×100%。

2．2．2 綠原酸、芍藥苷含量測定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:色譜柱為 Phenomenex C18(4．6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為甲醇(A)－1%磷酸溶液(B)梯度洗脫，洗脫條件見表1;DAD檢測器，檢測波長327 nm(綠原酸)，230 nm(芍藥苷);流速:0．8 ml/min;柱溫:40 ℃。

表1 流動相梯度洗脫

對照品溶液的配制:取綠原酸對照品、芍藥苷對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇溶解制成每1 ml分別含0．34 mg，0．11 mg的對照品溶液，即得(10℃以下保存)。

線性關(guān)系考察:精密吸取混合對照品溶液2．0，4．0，6．0，8．0，10．0 μl分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標，進行線性回歸，綠原酸的回歸方程為 Y=119 381．86X+0．47，線性范圍為 0．68 －3．40 μg(r=0．999 8);芍藥苷的回歸方程為 Y=554 197．55X+0．34，線性范圍為 0．22 －1．10 μg(r=0．999 6)。

供試品溶液的配制:精密量取提取濃縮液15 ml，水浴蒸干，轉(zhuǎn)移至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

陰性對照溶液的制備:按處方比例，稱取本處方中除金銀花、菊花、黃芩、黃柏外的各味藥材，分別加10倍水，煎煮兩次，每次2 h，減壓濃縮，定容至2000 ml，按上述供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液;另按處方比例同法制備缺赤芍、黃芩、黃柏的陰性對照溶液。

測定法:分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各5 μl，注入液相色譜儀測定其峰面積，計算綠原酸、芍藥苷含量。液相圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．3 正交試驗法優(yōu)選提取工藝

2．3．1 確定權(quán)重系數(shù) 以綠原酸、芍藥苷含量及干膏率3項指標為評價標準，其權(quán)重采用層次分析法(AHP)進行分析［3］。

建立評價目標樹雙花解毒顆粒提取工藝總評價目標可通過指標性成分、浸出物次級目標來反映，指標性成分通過綠原酸、芍藥苷2個目標來反映。

構(gòu)成兩兩比較優(yōu)先矩陣比較同一層次目標的相對重要性，并構(gòu)成兩兩比較矩陣。目標樹中3項目標成對比較的優(yōu)先矩陣見表2，評分標準見表3。

目標 綠原酸 芍藥苷 干膏率綠原酸135芍藥苷 1/3 1 3干膏率1/5 1/3 1

表3 3項目標成對比較評分標準

w1=2．466 21/(2．466 21+1．000 00+0．405 48)=0．636 98，同理可得:w2=0．258 28，w3=0．104 73。

計算權(quán)重系數(shù)隨機一致性比率 按公式CR=CI/RI計算隨機一致性比率為受檢驗層次的次目標數(shù))，查找相應的平均隨機一致性指標RI(random index)，見表 4。

表4 平均隨機一致性指標RI表

2．3．2 試驗設(shè)計 經(jīng)過預試驗，多方考察影響水煎煮的因素，選擇加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)為影響水煎煮的主因素，每個因素選取3個水平，以綠原酸、芍藥苷含量及干膏率綜合得分為評價指標，用L9(34)正交表安排試驗，因素水平與正交試驗設(shè)計見表5－6。

表5 因素水平

2．3．3 正交試驗安排及結(jié)果 按處方(除黃柏和黃芩外)比例稱取金銀花、菊花、赤芍等六味藥材135 g，共9份。根據(jù)L9(34)正交試驗設(shè)計表，將金銀花和菊花提取揮發(fā)油，過濾，濾液另存，備用;藥渣與其它四味藥材加水混合提取，提取完畢后，將不同條件下的水提液與上述濾液混合，分別濃縮至適量，定容至2000 ml，稱定重量，備用。以綠原酸、芍藥苷含量及干膏率為考察指標進行試驗。結(jié)果見表6～7。

表6 正交試驗結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

由直觀分析可知，綜合評分數(shù)據(jù)的極差大小顯示各因素主次為C＞A＞B，方差分析結(jié)果表明，A、C為主要因素，B為次要因素。綜合分析，考慮到工業(yè)生產(chǎn)節(jié)省時間，提高效率，最終確定最佳工藝為:加12倍量水煎煮2次，第一次1．5 h，第二次1．0 h。

2．3．4 最佳提取工藝驗證 為了進一步驗證正交試驗結(jié)果的準確性，以確保提取工藝合理可行，按上述最佳工藝條件重復安排3批試驗。結(jié)果見表8。

表8 最佳提取工藝驗證結(jié)果

3 討論

在測定指標成分含量時，以HPLC同時測定雙花解毒顆粒提取液中綠原酸、芍藥苷含量，對其方法學進行了考察，分離效果理想，重現(xiàn)性好，考慮到本文主要報道提取工藝研究，故暫未將其列入正文。

本試驗采用正交試驗的方法，以金銀花和菊花中綠原酸、赤芍中芍藥苷含量及干膏率為指標，運用多指標綜合評分法優(yōu)化提取工藝中加水量，煎煮時間、煎煮次數(shù)3個因素，得到最佳工藝，并經(jīng)驗證試驗最終確定提取工藝為12倍量水煎煮2次，第一次1．5 h，第二次1．0 h。結(jié)果表明優(yōu)選的提取工藝簡單，可操作性強。

［1］王筱亮，張玉杰，陳明霞，等．多指標正交試驗優(yōu)選酸棗仁最佳提取工藝［J］．中國中藥雜志，2005，30(10):753．

［2］李麗，周軍，張瑩，等．多指標綜合評分法優(yōu)化痛風寧顆粒提取工藝［J］．中成藥，2007，29(2):82．

［3］任愛農(nóng)，盧愛玲，田耀洲，等．層次分析法用于中藥復方提取工藝的多指標權(quán)重研究［J］．中國中藥雜志，2008，33(4):372 －374．

Optimization of Extraction Technology of the Water Extraction Part in Shuanghua Detoxification Granules by Orthogonal Design with Multi-targets

DING Zhi-jun，LIAO Yin-gen，LUO Mei-lan，TAN Zhi-jiang
Jiangxi Specialized subject hospital of skin，Nanchang 330001，China

Objective:To optimize the extraction technology for the water extraction part in Shuanghua detoxification Granules．Methods:With the yield of extracts yield and the contents of Chlorogenic acid and Paeoniflorin as indexes，orthogonal table L9(34)was used in the experiment of extracting in water to study the effect of technological parameters(the dosage of water，extraction times，the time of extraction)on the content of Chlorogenic acid and Paeoniflorin．Results:The optimum process is that water is used as extracting solution adding 12 times amount of solution，extracting 2 times，1．5 hours for the first time and 1．0 hour for the second time．Conclusion:The extraction process is stable and suitable for industrial production．

Shuanghua detoxification;Orthogonal test;Grading methods;HPLC

R 284．2

A

丁志軍(1981－)，男，漢族，工程師/中藥師，碩士，研究方向為中藥制劑。

2011-11-20)