本事琥珀散對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Th1/Th2漂移的影響*

★ 劉丹彤 張小勇 馬小娜 王冬 趙偉鵬 孫良明 趙妍 王慶國 (北京中醫(yī)藥大學2009級博士研究生 北京00029;2.北京中醫(yī)藥大學 北京00029)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指具有生長能力的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位的一種疾病，以痛經(jīng)、性交不適、不孕等為主要臨床癥狀［1］。近年來，EMs發(fā)病率有逐年上升的趨勢，且治療后復發(fā)率高，成為育齡期婦女的常見病、多發(fā)病，嚴重影響女性的生活質(zhì)量。本事琥珀散出自宋·許叔微的《普濟本事方》，由三棱、莪術(shù)、赤芍、劉寄奴、丹皮、肉桂、熟地、當歸、烏藥、元胡組成，具有行氣活血，溫經(jīng)止痛的功效，本為治療女子痛經(jīng)所設(shè)，現(xiàn)代亦常用來治療子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管阻塞性不孕等婦科疾病。在EMs的發(fā)病過程中，免疫失衡具有重要意義。Th1/Th2細胞的相互關(guān)系能夠反映機體的免疫狀態(tài)，因此Th1/Th2漂移與EMs密切相關(guān)。本研究擬探討本事琥珀散對EMs Th1/Th2細胞漂移的影響，為尋找本事琥珀散治療EMs的作用靶點打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級SD雌性成熟未孕大鼠，體重180g－200g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號SCXK(京):2008－0001，標準化環(huán)境(濕度:50% －70%，12h晝夜交替)飼養(yǎng)，每籠5只，予以滅菌飼料及飲水。

1.2 實驗藥品

本事琥珀散組成及用量:三棱10g，莪術(shù)10g，赤芍 15g，劉寄奴 10g，丹皮 6g，肉桂 10g，熟地 10g，烏藥10g，元胡10g，當歸15g。藥物劑量來自王慶國教授經(jīng)驗用量。飲片均購自北京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診部，由北京同仁堂藥店提供。藥物經(jīng)水浸泡半小時，煎煮40min后倒出藥液，再加水煎煮25min，將兩次煎得的藥液混合后加熱濃縮得到濃縮液。達那唑膠囊由江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號:20110102)。將膠囊打開，藥粉兌入蒸餾水中，按比例配制成懸浮液。以上藥品配制完成后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，每周更換一次藥液。

水合氯醛，天津市光復精細化工研究所，批號:20071129;注射用氨芐西林鈉，中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)，批號:09089024;己烯雌酚，合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號:20080616;生理鹽水由中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)，批號:20090123。IFN-γ、IL-4試劑盒，德國BENDER公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

50只SD大鼠隨機分為5組，即正常組、偽手術(shù)組、疾病模型組、本事琥珀散組和達那唑組。正常組常規(guī)飼養(yǎng);偽手術(shù)組做大網(wǎng)移植;疾病模型組、本事琥珀散組和達那唑組均采用自體移植法復制子宮內(nèi)膜異位癥模型。，于術(shù)前第5天和術(shù)后第10天開始給予己烯雌酚灌胃0.02 mg/kg，連續(xù)5 d，使手術(shù)時大鼠統(tǒng)一處于動情期;術(shù)后給予氨芐青霉素肌注16萬 u/kg，連續(xù)5 d。

造模1周后，各組開始灌胃給藥，連續(xù)4周。正常組和疾病模型組給予2ml生理鹽水灌胃，每日1次。其余各組藥量參照文獻換算，本事琥珀散組按成人公斤體重的8倍給藥(含生藥量為14g)，達那唑組按成人公斤體重的8倍給藥，16 mg/200g。

2.2 模型制作

(1)取雌性成熟未孕SD大鼠，于術(shù)前第5日和術(shù)后第10日開始給予己烯雌酚0.02mg/kg灌胃，每日一次，連續(xù)5日，使手術(shù)時大鼠統(tǒng)一處于動情期。

(2)手術(shù)在室溫23℃ ～28℃環(huán)境下進行，無菌操作。以10%水合氯醛(0.4ml/100g，腹腔注射)麻醉大鼠。

(3)待麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)板上，腹部備皮，常規(guī)消毒鋪巾。選取尿道口上端約1cm處為切入點，沿腹中線切開1.5～2 cm的縱形切口，逐層分離腹壁進入盆腔。探查大鼠子宮(呈V型)，細絲線結(jié)扎左側(cè)局部子宮血管以及需切除的子宮上下端。

(4)取大鼠左側(cè)子宮角長約1～2 cm，立即放入PBS溶液中，修剪去除子宮漿膜外的脂肪組織，縱向切開子宮腔，切取5×5 mm大小的子宮片段，使其內(nèi)膜面與右側(cè)腹膜相對，用5－0號絲線將其四角縫于右側(cè)腹壁，縫合處盡量遠離手術(shù)切口，以減少組織粘連，并防止取材再次開腹時損傷已種植的異位組織。剩余部分子宮片進行組織學觀察，以證實移植物確為子宮內(nèi)膜組織。

(5)關(guān)腹前向腹腔滴入以0.9%生理鹽水溶解的氨芐青霉素16萬u/kg進行腹腔消毒，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后第1日開始給予氨芐青霉素16萬u/kg肌肉注射，每日一次，連續(xù)5日。

(6)術(shù)后大鼠分籠單放，自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)。

建模4周后隨機選取2只模型大鼠開腹檢查移植物生長情況，并送病檢，驗證造模效果(結(jié)果如下圖)。

由上圖可見，疾病模型大鼠手術(shù)4周后移植物體積明顯增大，呈圓形，內(nèi)有半透明囊液，表面有結(jié)締組織覆蓋和血管形成，質(zhì)軟。病理檢查可見正常大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞排列整齊，呈長柱狀，肌層較厚，結(jié)構(gòu)完整，腺體和血管豐富;疾病模型大鼠移植物囊內(nèi)壁有內(nèi)膜上皮細胞及間質(zhì)細胞生長，上皮細胞呈低柱狀，較扁平，細胞結(jié)構(gòu)不清，肌層較薄，腺體較少。根據(jù)大體觀察以及病理檢查結(jié)果，可以認為EMs模型復制成功。

2.3 成模標準

取材時開腹觀察移植物，可見移植物體積增大，呈圓形或橢圓形囊泡，內(nèi)有透明或半透明囊液，部分為粘稠不透明液體，表面有血管形成。用游標卡尺測量移植物體積，根據(jù)Katsuki方法:體積(V)=長×寬×高，移植物體積≥8mm3者，即為模型復制成功［2、3］。

2.4 指標檢測

于造模后第5周，用10%的水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉動物，開腹(開腹時盡量避開造模時子宮內(nèi)膜種植部位)后，腹主動脈采血，用ELISA法檢測血清IFN-γ、IL-4水平。

2.5 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

與正常組比較，疾病模型組大鼠血清IFN-γ和IL-4含量分別呈升高和降低趨勢;與疾病模型組比較，本事琥珀散組IFN-γ和IL-4均有所降低和升高。疾病模型組IFN-γ/IL-4較正常組明顯升高，較本事琥珀散組明顯降低，組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。見下表。

本事琥珀散對EMs大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影響，注:與疾病模型組相比★P ＜0.05。

4 討論

作為適應性免疫應答的功能組成部分，T細胞在人體的免疫系統(tǒng)中占有重要地位，其中的輔助性T淋巴細胞(Th)與EMs存在著密切聯(lián)系。經(jīng)抗原刺激的前體細胞(Thp)分化而來的Th0經(jīng)細胞因子等多種因素影響向Th1或Th2分化發(fā)育。Th1、Th2細胞既在增殖分化的過程中受到細胞因子的影響，分化后又通過分泌多種細胞因子參與免疫調(diào)節(jié)并抑制Th0向另一類型Th細胞分化。Th1、Th2細胞和這些細胞因子之間相互作用，相互制約，調(diào)節(jié)著機體的免疫平衡狀態(tài)，維持正常的細胞免疫和體液免疫功能［4］。在某種狀態(tài)下，Th1/Th2的動態(tài)平衡被打破，出現(xiàn)偏向Th1或Th2的優(yōu)勢應答，就稱為Th1/Th2漂移［5］，會引起疾病的發(fā)生。目前已經(jīng)證實，許多腫瘤和自身免疫性疾病患者體內(nèi)均存在Thl/Th2漂移現(xiàn)象，且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。

Th1細胞主要是在抗原激活了靜息的細胞毒性T細胞(CTL)后協(xié)助其發(fā)育成為效應性T細胞，通過分泌細胞因子、激活巨噬細胞而介導細胞免疫效應和遲發(fā)性超敏反應。IFN-γ和IL-12通過信號傳導使T細胞增值分化為Th1細胞，分化后的Th1細胞主要產(chǎn)生 IFN-γ、IL-2［6］。Th2細胞則主要輔助 B細胞增殖分化成漿細胞，產(chǎn)生抗體，介導體液免疫效應。IL-4是促進初始T細胞分化為Th2細胞的重要因子，而Th2細胞又會產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子。一般認為，在同種器官的移植中，Th1參與了急性移植物的排斥，而Th2則更易于誘導移植耐受［7］。IFN-γ 和 IL-4 作為 Th1、Th2 細胞分泌的特征性細胞因子其含量及比值的變化被認為能夠間接反映 Th1/Th2 的平衡狀態(tài)［8］。

Hsu等［9］在1997年發(fā)現(xiàn)EMT患者外周血單核細胞和腹腔液中Th1細胞群功能下降，并認為這可能對EMT的發(fā)生具有始動作用。此后，許多研究均發(fā)現(xiàn)［10］、［11］EMs患者血清和腹腔液中存在 IFN-γ、IL-2水平低于正常婦女，而IL-4、IL-10水平升高的現(xiàn)象。但亦有研究表明在EMs或合并不孕患者的腹腔液中 IL-2 有所增高［12］、［13］，并認為正是因為IL-2的增多，誘導、促進了多種細胞毒細胞的活性，增強了機體免疫應答，從而導致了炎癥、疼痛和不孕的發(fā)生。

本實驗結(jié)果顯示:疾病模型組較正常組具有IFN-γ升高和IL-4降低的趨勢，尤其是IFN-γ/IL-4明顯升高。IFN-γ能夠激活巨噬細胞和NK細胞活性，促進機體免疫反應，并激活血管內(nèi)皮細胞，刺激ICAM-1表達，客觀上為移植物的種植生長提供了條件。IL-4能夠促進Th2細胞的分化、抑制Th1細胞增殖及應答。血清IFN-γ的升高和IL-4的降低提示機體免疫有由Th2向Th1漂移的傾向?？紤]本實驗中沒有出現(xiàn)被認為是EMs發(fā)生始動因素的Th1向Th2漂移現(xiàn)象，可能是EMs患者和動物模型的差別造成的。EMs患者的異位內(nèi)膜是主動異位，即首先是患者自身存在細胞免疫狀態(tài)的低下，繼而引起隨逆流經(jīng)血進入腹腔的子宮內(nèi)膜成功逃脫免疫監(jiān)視而種植下來;而EMs模型大鼠的異位內(nèi)膜則是被動異位，即子宮內(nèi)膜經(jīng)人為剝離種植在腹腔，種植之前大鼠本身并沒有機體免疫低下的情況存在。

本事琥珀散及達那唑均對EMs模型大鼠外周血Th2向Th1漂移的情況有糾正作用。雖然在IFN-γ和IL-4血清含量方面，本事琥珀散組和疾病模型組比較沒有顯著性差異，但IFN-γ/IL-4比值卻存在明顯變化。IFN-γ所代表的Th1細胞和IL-4所代表的Th2細胞之間存在一種相互抑制的關(guān)系。疾病模型組相較于正常組IFN-γ/IL-4比值的升高，提示Th1細胞占優(yōu)勢。此時，Th1細胞會憑借自身自分泌和旁分泌的功能，以及其所分泌細胞因子對Th2細胞的抑制作用，并且隨著病情的發(fā)展，Th1細胞的優(yōu)勢被逐漸放大。而本事琥珀散組IFN-γ/IL-4比疾病模型組明顯降低，說明在本事琥珀散的作用下，Th1細胞的優(yōu)勢被抑制，從而起到了對 EMs Th1/Th2漂移的調(diào)節(jié)作用。

本事琥珀散對細胞免疫的調(diào)節(jié)作用可能與其行氣活血的功效有關(guān)。有研究［14］發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散能夠調(diào)節(jié)肝郁證大鼠Th2向Th1漂移的現(xiàn)象。柴胡疏肝散是疏肝行氣活血的代表方之一，因而可以推斷行氣活血功效在調(diào)節(jié)Th/Th2漂移方面有所作為，但其作用機制尚需進一步研究。至于本事琥珀散是否對Th1/Th2的漂移具有雙向調(diào)節(jié)作用，即是否會對造成EMs發(fā)生的細胞免疫低下狀態(tài)有改善作用，還需進一步的臨床觀察。

［1］樂杰.婦產(chǎn)科學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，354.

［2］常暖，韓冰，李同璽.大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立及其病理學觀察［J］.臨床與實驗病理學雜志，1998，14(1):67 －69.

［3］葉蘭.加味三棱丸主要成分抗大鼠子宮內(nèi)膜異位癥血管生成與侵襲及其作用機制研究［D］.重慶醫(yī)科大學，2009.

［4］Wan YY，F(xiàn)lavell RA.How diverse-CD4 effector T cells and their functions［J］.J Mol Cell Biol，2009，1(1):20－36

［5］張蕾，吳瑞瑾，林俊.Th1/Th2漂移與子宮內(nèi)膜異位癥［J］.國際婦產(chǎn)科學雜志，2008，35(4):268 －271.

［6］裴非力.醫(yī)學免疫學［M］.北京:科學出版社，2009:162.

［7］鐘逶迤，任燕，楊業(yè)金，等.免疫因素在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中的研究進展［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2009，36(5):996 －1001.

［8］Enriquez J，Klinger J，Arturo JA，etal.Peritonitis in continuous ambulatory peritoneal dialysis:cytokines in peritoneal fluid and blood［J］.Adv Perit Dial，2002，18:177 －183.

［9］Hsu CC，Yang BC，W u M H，Huang KE.Enhanced interleukin-4 experssion in patients with endometriosis［J］.Fertil Steril，1997，67:1059－1064.

［10］Hill JA Immunology and endometriosis［J］.Ferstil Steril，1992，58(3):262.

［11］左陽花，蘇兆亮，王勝軍，許化溪.子宮內(nèi)膜異位癥患者血清IL-4/IFN-γ 和 TGF-β/IL-17 的變化及意義［J］.免疫學雜志，2011，27(10):883 －885，889.

［12］Hill JA，Ahclerson DJ.Lymphocyte activity in the presence of peritoneal fluid from fertile women and infertile women with and without endometriosis［J］.Am J Obstet Gynecol，1989，161:861 －864.

［13］郎景和.關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥的再認識及其意義［J］.中國工程科學，2009，11(10):137－142.

［14］楊冬花，李家邦，鄭愛華，蔣榮鑫.肝氣郁結(jié)模型大鼠T細胞免疫功能的改變及柴胡疏肝散的治療作用［J］.四川中醫(yī)，2006，24(4):14－16.