局部應(yīng)用菟絲子總多糖對家兔骨折修復中TGF-β1表達的實驗研究*

★ 李緒松 鄭臣校 付光明 (廣東省中山市中醫(yī)院 中山528400)

中醫(yī)骨傷科對骨折的治療遵從于復位、固定、功能鍛煉和三期辯證用藥的一般原則。強調(diào)“腎藏精，主骨生髓”理論指導下的骨折用藥方法。結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗，以及現(xiàn)代藥理對中藥多糖類的研究進展，我們對菟絲子總多糖進行了創(chuàng)新性使用，觀察菟絲子總多糖局部應(yīng)用對家兔骨折的修復TGF-β1表達情況。以說明補腎中藥促進骨折修復的可行性和部分內(nèi)涵。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及分組

選用健康成年家兔63只，體重(2.3±0.3)kg，按性別隨機分為三組:菟絲子總多糖組(A組)、BMP/明膠復合物組(B組)以及空白對照組(C組)。每組21只兔。

1.2 主要實驗試劑與器材

菟絲子總多糖(廣州中醫(yī)藥大學藥學院中藥制劑室提供);人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(human bone morphogenetic protein，rhBMP)(天津中津生物發(fā)展有限公司提供);明膠(成都科龍化工試劑廠生產(chǎn));TGF-β1免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色液(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));戊巴比妥鈉(上海化學試劑采購供應(yīng)站分裝廠進口分裝);Leitz wetzlar 1512型石蠟切片機(德國生產(chǎn));CK-2型普通光學顯微鏡(日本Olympus公司生產(chǎn))。

2 實驗方法

2.1 實驗動物的造模

以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉成功。家兔取仰臥位，四肢固定于自制兔板上，搬運至手術(shù)臺上。通過脛腓骨前外側(cè)入路，切口約5～6 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及關(guān)節(jié)囊，顯露家兔脛骨。盡量不損傷骨膜。使用線鋸將脛骨截斷，并形成一約0.5 cm的骨缺損區(qū)域。慶大霉素-生理鹽水沖洗后，對A、B、C三組分別給予中藥菟絲子總多糖、BMP/明膠復合物以及空白處理。然后逐層縫合骨膜及肌肉、筋膜層以及皮膚切口。術(shù)后傷口外涂紅霉素眼膏，每只動物每天肌注青霉素鈉3?105 U，每天一次，共7天。常規(guī)進食，分籠飼養(yǎng)，自由活動，予以夾板外固定。術(shù)后2、4、8周，沿原手術(shù)切口取下骨折的脛骨，修剪周圍的軟組織，用4%多聚甲醛固定，4℃過夜，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，置入20%二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)pH值7.4的磷酸緩沖液中，室溫下脫鈣10天，中間換液一次，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟4 h，軟蠟包埋。切片厚度5 μm，37℃烤片過夜。行TGF-β1免疫組化;并處死動物送標本。8周處死所有實驗動物。

2.2 觀察指標及測定方法

應(yīng)用TGF-β1免疫組化的方法，切片經(jīng)二甲苯脫蠟4 h，梯度酒精水化，0.3%過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%羊血清封閉后，加1∶100稀釋的兔抗鼠TGF-β1抗體，4℃過夜，復溫沖洗后加1∶300稀釋的羊抗兔抗體，37℃孵育30 min，沖洗后再加1∶300稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉卵白素，37℃孵育30 min，沖洗后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，梯度酒精脫水二甲苯透明后封片。觀察各組術(shù)后切片修復組織的積分光密度值(IOD)并進行統(tǒng)計學分析。

2.3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理:計量資料，以均數(shù)加減標準差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);經(jīng)正態(tài)分布檢驗，方差齊性檢驗用Homageneity of variance test。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況

術(shù)后實驗動物切口均于5～7天愈合，A組1只共1個骨折端，B組2只共2個骨折端，C組1只共1個骨折端術(shù)后2～3天曾出現(xiàn)腫脹積液，給予消毒后穿刺積液抽吸為淡黃色質(zhì)稀液體。

3.2 TGF-β1 免疫組化

免疫組織化學主要原理是用標記的抗體對細胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原進行定性、定位和定量檢測。其優(yōu)點是具有高度的特異性、敏感性和精確性。陽性結(jié)果時采用了對切片修復組織的積分光密度值(IOD)進行統(tǒng)計。IOD能反映出被測個體截面或投影輪廓內(nèi)總的吸光度，由各像素點光密度值直接相加，表示組織細胞截面或投影輪廓內(nèi)染色的深淺總量。

表1 TGF-β1免疫組化IOD組間比較(±s)

表1 TGF-β1免疫組化IOD組間比較(±s)

與空白組比較:△P ＜0.05，★P ＜0.01。

組別 標本數(shù)量 2周 4周 8周A 組 7 59.25 ±12.47★ 84.86 ±22.57★ 76.96 ±19.57★B 組 7 56.67 ±15.43 76.81 ±24.49★ 68.17 ±7.66★C組7 37.48 ±13.54 31.83 ±9.26 27.62 ±8.32

由表1可以看出:2、4、8周時，中藥組、BMP組TGF-β1免疫組化積分光密度值與空白組比較，都有顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05);中藥組與BMP組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示:菟絲子總多糖及BMP/明膠復合物能夠提高修復組織的TGF-β1分泌表達，為骨折修復組織的生長、塑形提供基質(zhì)材料。

4 結(jié)論

菟絲子總多糖與空白組比較在2、4、8周均有顯著性差異;與BMP組比較沒有統(tǒng)計學意義，但表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。提示在骨折愈合的不同階段，產(chǎn)生TGF-β1的細胞是不同的，表達量也不同，上述變化與組織學改變密切相關(guān)。而且與相應(yīng)細胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)，這說明菟絲子總多糖可促進TGF-β1參與調(diào)節(jié)骨折修復。一定程度證實了利用補腎中藥菟絲子對骨折損傷的修復作用，也符合骨折治療中強調(diào)補肝腎補氣血的用藥原則。

5 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在骨折治療中發(fā)揮著重要作用，其治療原則仍以骨折復位、固定、功能鍛煉為一般原則，臨床用藥遵從三期辯證用藥。目前大部分報道集中在復方制劑對促進骨折愈合的臨床療效觀察和單味中藥有效單體成分實驗觀察階段。隨著分子生物學、組織工程、基因工程的研究深入，中醫(yī)對骨折損傷的理論應(yīng)當有所針對性創(chuàng)新，并對有利于骨折修復的補腎活血類中藥有效藥用成分以及藥理作用環(huán)節(jié)進行明確的研究。有學者研究表明［1］，TGF-β1表達量和組織學分布的變化與骨折愈合過程中相應(yīng)的組織學變化密切相關(guān)，而且與相應(yīng)細胞的功能狀態(tài)相關(guān)，說明TGF-β1是調(diào)節(jié)骨折愈合過程的重要因子以便在骨折修復修復領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學研究提示菟絲子能夠促進造血功能，能促進骨髓造血干細胞的增殖，而髓腔內(nèi)干細胞同時包括了骨髓間充質(zhì)干細胞，為菟絲子補腎生髓養(yǎng)骨提供了依據(jù)。王建紅等［2］發(fā)現(xiàn)菟絲子黃酮能下調(diào)心理應(yīng)激大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)β-EP，上調(diào)腺垂體L H水平?，F(xiàn)代藥理學研究［3］表明:菟絲子還能提高免疫功能，清除氧自由基、活性氧及抗脂質(zhì)過氧化，增強體液免疫功能;具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)樣作用和類似雌激素樣作用，通過作用于不同的靶腺軸起到調(diào)節(jié)骨軟骨代謝的作用。現(xiàn)代藥理學研究提示多糖可能是補腎藥藥理作用的重要基礎(chǔ)，目前研究較多的有枸杞多糖、菟絲子總多糖、地黃多糖、黃芪多糖、人參多糖以及六味地黃多糖等復方多糖。它們的共同功效包括［4］:能提高免疫功能，清除氧自由基、活性氧及抗脂質(zhì)過氧化等;菟絲子總多糖同時具有良好的成膜性和凝膠化能力，對溫度和PH值穩(wěn)定性好，具有生物相容性和生物降解性，水溶性好。通過制成水凝膠具有定形和緩釋作用，在既往試驗中，有學者［5］觀察到菟絲子總多糖凝膠在骨質(zhì)缺損內(nèi)2～4周內(nèi)完全吸收，與促進Ⅱ型膠原mRNA表達四周達峰一致。并且與BMP凝膠組沒有明顯差異，而且略有優(yōu)勢，菟絲子總多糖凝膠發(fā)揮了促進骨折修復因素與臨時基質(zhì)結(jié)合體的作用。

本次實驗，通過對菟絲子總多糖的創(chuàng)新性使用，提示可能在骨組織工程中種子細胞的體外培養(yǎng)以及輔助各種生長因子實現(xiàn)增效方面發(fā)揮積極的作用。在骨折愈合的不同階段，TGF-β1是參與調(diào)節(jié)骨折修復的重要因子。但機體對骨折愈合過程的調(diào)控是復雜的，單一因子不能解釋其全部內(nèi)容［6］。關(guān)于骨折愈合過程中應(yīng)用菟絲子總多糖等類似的中藥提取物對其它相關(guān)因子表達的影響，以及生長因子局部應(yīng)用促進骨折愈合等問題，尚待進一步研究。本實驗所選菟絲子的多糖成份有很強粘合的作用，既有對骨折斷端的固定粘接功效，又可促進骨折的修復，具雙重作用，在目前骨折的修復治療中具有極強的創(chuàng)新性。是對中藥利用傳統(tǒng)認識結(jié)合現(xiàn)代藥理、病理進展提示做出的一次大膽嘗試，對我們?nèi)蘸笱芯恐嗅t(yī)理論、開發(fā)新藥提出了更廣闊的道路。有利于拓展中藥的使用范圍，增加新的給藥途徑和提高臨床療效，從而提高中醫(yī)藥的競爭力，更好的為人類健康謀福利。

［1］姬洪全，黨耕町，馬慶軍，等.骨折愈合過程中轉(zhuǎn)化生長因子β1表達的實驗研究［J］.中華外科雜志，1998，36(2):72－73.

［2］王建紅，王敏璋，歐陽棟，等.菟絲子黃酮對心理應(yīng)激雌性大鼠下丘腦 β-EP 與腺垂體 FSH、LH的影響［J］.中藥材，2002，12(25):886－888.

［3］何清義，李起鴻，楊柳，等.人關(guān)節(jié)軟骨細胞的永生化及其表型的誘導［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2002，18:727 －731.

［4］張振明，蔡曦光，葛斌.許愛霞女貞子多糖和菟絲子總多糖的協(xié)同抗衰老作用及其機制［J］.中國藥理學通報，2005，5(21):587－590.

［5］林慧彬，林建群，林建強.山東4種菟絲子生物學特性研究［J］.中國野生植物資源，2008，1(28):34 －35.

［6］李瑛，鄒季，熊勇，等小夾板固定對實驗性骨折愈合的VEGF及TGF-β1 表達的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2007，15(9):32－35.