正交試驗法優(yōu)選小白蒿炭炮制工藝研究

劉永喜

(內蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內蒙古 呼和浩特 010065)

小白蒿，別名冷蒿，蒙名阿給，系菊科蒿屬植物冷蒿Artemisia frigida Willd.的地上部分，具有止血、消腫、制伏癰疽等功能，是民間和蒙醫(yī)臨床主治各種出血病的常用藥材［1］。最早《四部醫(yī)典》有記載“止血選用小白蒿炭”。

蒙醫(yī)一直都有阿給煅炭止血的應用，而且取得了顯著的成效。崔箭［2］等將蒙藥阿給制炭后用于支氣管擴張咯血的治療，取得了確切的療效。田華詠［3］的《中國民族藥炮制集成》中提出阿給制炭的炮制方法為:取凈藥材，置鍋內，明火炒至黑色或炭時，取出，放涼。謝坤［4］等運用磷鉬鎢酸－干酪素法建立了阿給生藥及炭藥中鞣質含量測定方法，阿給制炭后鞣質含量明顯降低。張婉［5］等采用紫外分光光度法測定阿給生藥及炭藥中總黃酮的含量，結果生藥中總

黃酮含量約為炭藥的2倍。由此說明小白蒿炭的止血作用并不與鞣質和總黃酮含量呈平行關系，而可能與炒炭過程中原有成分的比例改變，或者產生了新的成分，如止血與抗止血成分比例的變化及炭素的產生等有關。大量研究表明，炭藥止血不僅與鞣質含量有關而且與可溶性鈣離子、止血抗止血成分及炭素等因素有關［6］。另外，文獻［7］報道有些黃酮類化合物也具有止血的作用。因此，本實驗采用 L9(34)正交試驗法，以5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮、5，3'－二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮和鞣質在炮制過程中的變化為考察指標，對小白蒿炭的炮制工藝進行優(yōu)化。

1 實驗材料

1.1 儀器:UV－3000型雙波長/雙光束紫外－可見分光光度計(日本島津公司);高效液相色譜儀(LC10－Atvp輸液泵，SPD－M10Avp檢測器，SCL－10Avp工作站，DGU－12A脫氣機);AUW220D型自動電子天平(日本島津公司);KQ－100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SYZ－A型石英亞沸高純水蒸餾器(江蘇金城國勝實驗儀器廠)

1.2 試藥:鞣酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，編號:110831 －200302);5，7，3'－三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮和5，3'－二羥基－6，7，4'－三甲氧基黃酮均自制。大孔樹脂D101(天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司);硅膠G(上海海洋化工廠);乙腈和甲醇為色譜純(天津市光復精細化工研究所)，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材:實驗中所用的小白蒿采集地點為內蒙古通遼市扎魯特旗罕山，并經內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院蒙藥生藥教研室主任布和巴特爾鑒定為菊科蒿屬植物冷蒿Artemisia frigida Willd.的地上部分。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計:錢云川［8］“中藥炒炭質量控制”論文中指出，炒炭質量控制要點是控制火候掌握溫度、每次入鍋量和炒炭程度。這充分說明炒炭炮制過程中主要影響因素是溫度、藥材量和時間。以小白蒿的傳統(tǒng)炮制工藝為參照，同時結合預試驗，確定影響小白蒿炭炮制工藝的主要因素為炒炭溫度(A)、炒炭時間(B)及藥材重量(C)，采用正交試驗對這3個因素進行考察，每個因素擬定3個水平，見表1。按表L9(34)安排進行試驗，共炒制得9份小白蒿炭樣品，待用。1－9號樣品段長均約為10mm，顏色見表2。

表1 因素水平表

表2 成品性狀表

2.2 鞣質含量測定

2.2.1 鞣酸儲備液的制備:精密稱取鞣酸對照品20.00mg于10mL棕色容量瓶中，加30%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備:取小白蒿炭粉末0.5g，精密稱定，置具塞棕色錐形瓶中，精密加入30%甲醇25.00mL，浸泡24h，過濾，棄去初濾液5mL，精密吸取續(xù)濾液2mL，置50mL棕色容量瓶中，加30%甲醇定容至刻度，搖勻，既得供試品溶液。

2.2.3 測定波長選擇:吸取對照品溶液和小白蒿炭供試液適量置石英比色皿中，在200～400nm范圍內進行掃描，結果見圖1。

圖1 小白蒿炭供試液和鞣酸對照液UV掃描圖(A、小白蒿炭供試液;B、鞣酸對照液)

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 標準曲線繪制:精密吸取鞣酸儲備液的制備液適量，分別置25ml棕色容量瓶中，加30%甲醇至刻度，搖勻，既得不同濃度系列對照品溶液。以相應的試劑為空白，在276nm波長處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程式為y=0.043x+0.0863(r=0.9993)，線性范圍為 2.00 ～22.00'g.mL－1。

2.2.4.2 精密度試驗:取3號對照品溶液，連續(xù)測定6次。結果的RSD為1.08%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗:取6號供試液適量，在12h內，每隔一定時間測定1次，共測6次。結果RSD為1.36%。

2.2.4.4 重復性試驗:取6 號樣品，每份 0.5g，共 6 份，按供試品溶液法制備，含量測定項下操作。結果的RSD為1.52%，表明方法重現性良好。

2.2.4.5 加樣回收試驗:取 6號樣品粉末 0.25g，共 6份，分別加入鞣酸對照品適量，按供試品溶液方法制備，含量測定項下操作，結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果

2.2.5 樣品含量測定:分別精密吸取供試液1mL，置25mL棕色容量瓶中，加30%甲醇至刻度。在276nm處測定吸光度，計算結果。

2.3 黃酮含量測定

2.3.1 提取溶劑的選擇和預處理:稱取6號樣品3份，每份為0.1g，精密稱定，以氯仿、氯仿:甲醇(1:1)、甲醇為溶劑，分別加20mL，超聲處理30min，濾過。分別吸取濾液10mL，放入已裝好40g大孔樹脂(D101)的色譜柱，先用20%乙醇溶液50mL洗脫，然后用無水乙醇100mL洗脫。把無水乙醇部分減壓回收至干，加色譜乙腈溶解并定容至10ml容量瓶中。在實驗所用的色譜條件下，測定色譜圖。實驗結果表明，氯仿的提取率與其他兩種溶劑的相當，并且預處理后的色譜峰清晰，分離度較好。預處理中先用20%的乙醇50mL洗脫，兩種成分均沒有洗脫下來。然后用無水乙醇100mL洗脫，不僅兩種成分均完全洗脫下來 ，而且與其他雜質分離。選定氯仿為提取溶劑，預處理方法為先用20%乙醇溶液50mL洗脫，然后用無水乙醇100mL洗脫。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗:色譜柱:大連依利特hypersil ODS2 柱 (200mm × 4.6mm，5μm);檢 測 波 長274nm，流動相:乙腈－0.2%磷酸溶液，梯度洗脫;流速1.0mL.min－1，記錄色譜圖時間40min;進樣量:20'L。在上述色譜條件下，5，7，3'－三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)達到基線分離(R＞1.5)，理論塔板數均不低于3500，結果見圖2.

圖2 小白蒿炭供試液和混合對照品溶液色譜圖(A、混合對照品溶液;B、小白蒿炭供試液)

2.3.3 線性關系考察:精密稱取 5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)適量，加色譜乙腈溶解并配成濃度為1mg/ml的對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，分別用色譜乙腈配成不同濃度的系列對照品溶液，按上述色譜條件和方法分析測定，以對照品的濃度為橫坐標，對照品峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算其回歸方程式，分別為y=1.229×105x－4444(r=0.9991)，線性范圍為 5.00 ～40.00g.mL－1;y=2.527 ×105x－3111(r=0.9999)，線性范圍為 2.00 ～40.00g.mL－1。

2.3.4 精密度試驗:分別精密吸取對照品儲備液適量，分別用色譜乙腈稀釋至6μg/ml對照品溶液。在上述色譜條件下，進樣量20μL，進樣6次，測得峰面積，計算RSD值分別為 1.98%和 1.02%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗:精密吸取6號供試液20μl，注入色譜儀，在24h內每隔一定時間測定1次，進行穩(wěn)定性考察。在24h內測定5次，數據穩(wěn)定。5，7，3'－三羥基 －6，4'－二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)的RSD分別為1.20%和1.12%。

2.3.6 重復性試驗:取6號供試品6份，精密稱定，按含量測定方法進行測定，5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)的 RSD分別為1.18%和1.73%。

2.3.7 加樣回收率試驗:取6號樣品粉末0.05g，共6份，分別加入5，7，3?－三羥基 －6，4'－二甲氧基黃酮(1)，5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮(2)對照品適量，按供試品溶液方法制備，含量測定項下操作，結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果

2.3.8 含量測定:分別稱取不同樣品的小白蒿0.1g，精密稱定，加氯仿20ml，超聲處理30min，濾過。分別吸取濾液10mL，蒸干，加20%甲醇10mL，溶解后放入已裝好40g大孔樹脂(D101)的色譜柱，先用20%乙醇溶液50mL洗脫，然后用無水乙醇100mL洗脫。把無水乙醇部分減壓回收至干，加色譜乙腈溶解并定容至25ml，既得樣品供試液。分別精密吸取樣品供試液20μL，注入色譜儀，掃描，測定，計算其含量。

2.4 正交試驗結果:結果見表5。從表5的直觀分析及表6～表8的方差分析結果可以得出:影響鞣質的因素依次為，A＞B＞C，最佳搭配為A1B1C2，但在此條件下制得的飲片性狀不符和藥典規(guī)定。影響5，7，3'－三羥基－6，4'－二甲氧基黃酮的因素依次為，A＞B＞C，最佳搭配為A1B1C3，但在此條件下制得的飲片性狀與A1B1C2相近。影響5，3'－二羥基－6，7，4'－三甲氧基黃酮的因素依次為，A＞B＞C，最佳搭配為A3B3C1，而在此條件下得到的飲片不能保持原生藥形態(tài)而且部分變成灰分。因此，綜合考慮實際生產成本、效率及正交試驗結果等因素，選定炒小白蒿的最佳工藝為:A2B2C2。

表5 L9(34)正交試驗表及實驗結果

表6 鞣質方差分析表

表7 5，7，3'－三羥基－6，4'－二甲氧基黃酮方差分析表

表8 5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－ 三甲氧基黃酮方差分析表

2.5 小白蒿炭炮制工藝驗證與生藥比較

2.5.1 炮制工藝驗證:按照優(yōu)化工藝進行小白蒿炒炭炮制工藝的驗證試驗，即取小白蒿40g，炒炭溫度為220℃，炒炭的時間為20 min，炮制成小白蒿炭。分別對3批小白蒿炭中鞣質、5，7，3'－ 三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮和 5，3'－二羥基－6，7，4'－三甲氧基黃酮的含量進行測定。結果分別為 7.18、2.38 和 2.54mg.g－1。

2.5.2 與生藥比較

2.5.2.1 鞣質含量比較:稱取小白蒿6 份，每份0.5g，精密稱定，照“2.2.2”項下制備供試液，在“2.2.5”項下進行測定，結果為14.084mg.g－1。小白蒿制炭后鞣質含量明顯降低。

2.5.2.2 黃酮的比較:稱取小白蒿6 份，每份0.1g，精密稱定，照“2.3.8”項下制備供試液并進行測定，結果 5，7，3'－三羥基 －6，4'－ 二甲氧基黃酮和 5，3'－ 二羥基 －6，7，4'－三甲氧基黃酮的含量分別為 6.53 和 1.09 4mg.g－1，色譜圖見3。從圖3可知，小白蒿炭和生藥色譜圖不一致，有的峰減弱甚至消失，有的峰增強乃至出現與生藥不同的色譜峰。

圖3 小白蒿炭和生藥色譜圖

3 討論

3.1 在試驗設計時考慮到小白蒿炒炭的傳統(tǒng)工藝中常用鐵鍋，而鐵元素對人體影響較小，又適合工廠生產，且成本較低，故確定鍋的品質為鐵鍋。

3.2 全草類藥物炒至焦褐色，仍保持原生藥形態(tài)為度，如果炒成炭黑色就太過了［9］;每次入鍋量以鍋容量30% ～50%為宜，過多則難以翻炒均勻。故我們通過預實驗確定了炒炭溫度、炒炭時間及藥材重量等因素的3個水平。

3.3 本實驗鞣質含量測定時，藥材與對照品進行了UV掃描，在300～400nm區(qū)域內藥材有一個吸收帶外，200～300nm內藥材與對照品的峰位和峰形比較相似，同時檢測波長(276nm)處對藥材作了吸收度和濃度曲線，其線性良好(r=0.9994)，說明在276nm處測定具有可行性。此外，考察了水、10%甲醇、30%甲醇和50%甲醇等溶劑提取率。結果表明，30%甲醇的提取率不僅高于水和10%甲醇而且與50%甲醇比較在300～400nm區(qū)域內吸收帶強度弱。

3.4 實驗結果表明，小白蒿炭的作用機理及其止血成分較為復雜。小白蒿炭的止血作用并不與鞣質和總黃酮含量呈平行關系，而可能與炒炭過程中原有成分的比例改變，或者產生了新的成分，如止血與抗止血成分比例的變化及炭素的產生等有關。

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