復(fù)合酶法超聲輔助提取高寒香菊花多糖*

敬思群，張曉鳴

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)2(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊，830046)

復(fù)合酶法超聲輔助提取高寒香菊花多糖*

敬思群1，2，張曉鳴1

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)2(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊，830046)

通過(guò)對(duì)復(fù)合酶超聲輔助提取高寒香菊花多糖的工藝研究，以提取得率和純度為指標(biāo)，確定了適宜工藝條件。以未經(jīng)酶解和未采用超聲處理的多糖做對(duì)照，通過(guò)近紅外光譜分析加酶及超聲處理對(duì)高寒香菊花多糖結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:在復(fù)合酶2.5%(纖維素酶2.0%，酸性蛋白酶0.5%)，酶解溫度55℃，pH值4.5的條件下酶解2.0 h，多糖提取得率和純度分別達(dá)到9.83%和28.58%，經(jīng)聚酰胺柱純化后純度為64.57%。近紅外光譜分析表明加酶和超聲對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響，但提高了多糖提取得率。

復(fù)合酶，超聲輔助提取，高寒香菊花多糖，光譜分析

高寒香菊(Coreopsis basalis)屬一年生草本植物，全株無(wú)毛，葉羽狀深裂，裂片線形，在我國(guó)主要分布于新疆海拔3 000 m左右的昆侖山區(qū)。高寒香菊降血壓降血脂效果非常好，是一味能夠治療高血脂等心血管疾病的中草藥［1－2］。文中對(duì)高寒香菊花多糖的提取工藝進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

高寒香菊花，由新疆和田沙漠玫瑰有限責(zé)任公司提供;三氯甲烷、正丁醇、丙酮、濃硫酸、碘化鉀、苯酚、磷酸氫二鈉、檸檬酸等化學(xué)試劑，均為分析純;聚酰胺，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;纖維素酶(40 000 U/g)和酸性蛋白酶(50 000 U/g)，均購(gòu)于杰諾生物科技有限公司。

AL104分析天平(Mettler-Toledo Group)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，Anke TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠FZ102)，SIM真空冷凍干燥設(shè)備(德國(guó)西門(mén)子公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，722S型分光光度計(jì)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，VERTEX70型紅外光譜分析儀(BRUKER公司)。

1.2 方法

1.2.1 高寒香菊多糖提取工藝流程［3－5］

高寒香菊花→粉碎→過(guò)篩→加水混勻→調(diào)pH值→超聲處理→加酶→滅酶→冷卻→離心→收集上清液→去蛋白→濃縮→醇沉→洗滌→冷凍干燥→稱(chēng)重

1.2.2 操作要點(diǎn)

(1)原料預(yù)處理:將高寒香菊花放入50℃烘箱中干燥24 h取出磨成細(xì)粉，過(guò)80目篩，密封后保存。

(2)超聲處理:精密稱(chēng)取高寒香菊花粉末1.0 g，置于100 mL三角瓶中，取5 mL水混均后，加10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值后進(jìn)行超聲處理(40℃，15 min，36 kHz)。

(3)酶解:按一定比例量取酸性蛋白酶和纖維素酶后混合，將混合酶液加入到高寒香菊溶液中，將加入酶液的溶液在55℃水浴鍋中加熱1 h后在90℃下滅酶10 min，冷卻至室溫。

(4)離心:將滅酶后的溶液在3 500 r/min下離心15 min，取上清液，按以上操作將殘?jiān)貜?fù)提取3次，合并上清液。

(5)去蛋白:上清液用 severag法［6］［V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=5∶1］去蛋白。

(6)濃縮:將除去蛋白的多糖溶液濃縮至1/3。(7)乙醇醇沉:濃縮后的溶液加入5倍體積的95%的乙醇進(jìn)行醇沉。

(8)洗滌:沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次。

(9)烘干稱(chēng)重:將得到的多糖進(jìn)行冷凍干燥并稱(chēng)重。

1.2.3 酶活力的測(cè)定

酸性蛋白酶酶活按SB/T10317－1999測(cè)定，纖維素酶酶活按GB/T23881－2009測(cè)定。

1.2.4 高寒香菊多糖提取得率和純度的計(jì)算

多糖含量測(cè)定采用硫酸-苯酚比色法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法參考文獻(xiàn)［7］，得線性回歸方程為:Y=0.003 5X －0.017 3(Y:吸光度，X:糖含量)。

1.2.4.1 高寒香菊多糖提取得率和純度的計(jì)算

式中:W為高寒香菊多糖的提取得率，%;m1為提取得到的高寒香菊多糖質(zhì)量，g;m2為原料質(zhì)量，g。

1.2.4.2 高寒香菊多糖的純化［8］

將得到的高寒香菊多糖濾液過(guò)聚酰胺柱。上柱時(shí)，聚酰胺用量為需脫色粗多糖的4倍，聚酰胺柱用1倍體積的去離子水以1.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。將純化后樣液移入250 mL容量瓶，定容。移取樣品溶液1 mL置于具塞試管中，按照1.4.1方法測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算多糖含量。

純化后高寒香菊多糖純度計(jì)算

式中:C為高寒香菊多糖的純度，%;m1為純化后得到的高寒香菊多糖質(zhì)量，g;m2為純化前高寒香菊多糖提取物質(zhì)量，g。

1.2.5 高寒香菊花多糖的光譜分析

分別取2 mg加酶超聲處理、加酶未經(jīng)超聲處理、未經(jīng)加酶超聲處理、未加酶未采用超聲處理的4組高寒香菊多糖干燥樣品，與200 mg干燥的KBr粉末在紅外燈下于瑪瑙缽中輕輕研磨均勻，研磨均勻的粉末經(jīng)壓片機(jī)壓成薄片后即可上機(jī)測(cè)定。測(cè)定條件:在500～4 000 cm－1內(nèi)，掃描累積次數(shù)64次，分辨率4.0 cm－1，采集樣品的紅外光譜譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種酶的酶活

酸性蛋白酶和纖維素酶兩種酶的酶活見(jiàn)表1。

表1 不同酶酶活力

2.3 復(fù)合酶超聲輔助提取高寒香菊多糖工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值對(duì)高寒香菊花多糖提取得率和純度的影響

加入2%的纖維素酶和0.5%的酸性蛋白酶，在酶解溫度55℃下酶解2.5 h，調(diào)節(jié)pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，測(cè)定多糖提取得率和純度。

圖1 pH值對(duì)高寒香菊多糖提取得率和純度的影響

由圖1可知，隨著pH值的增加，高寒香菊花多糖的提取得率和純度提高，在pH=4.5時(shí)高寒香菊花多糖的提取得率和純度達(dá)到最大值，增大pH值，高寒香菊花多糖提取得率反而下降，純度的變化趨勢(shì)與提取得率相似，這可能是因?yàn)槊赣衅渥饔玫淖钸mpH值，高于此值，結(jié)構(gòu)解離，活性降低，則提取得率降低。

2.3.2 溫度對(duì)高寒香菊花多糖提取得率和純度的影響

加入2%的纖維素酶和0.5%的酸性蛋白酶，調(diào)節(jié) pH 值為4.5，在溫度為 40、45、50、55、60℃下酶解2.5 h，測(cè)定多糖提取得率和純度。

圖2 溫度對(duì)多糖提取得率和純度的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，高寒香菊花多糖的提取得率增加，在55℃時(shí)達(dá)到最高，但隨著溫度的繼續(xù)升高，提取得率反而降低，這可能是因?yàn)槊傅淖钸m溫度為55℃，在最適溫度下酶的活性最大，提取得率最高，而高于最適溫度，酶的活性降低，提取得率就降低。

2.3.3 時(shí)間對(duì)高寒香菊花多糖提取得率和純度的影響

加入2%的纖維素酶和0.5%的酸性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH 值為 4.5，在溫度為 55℃下，酶解 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，測(cè)定多糖提取得率和純度。

由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高寒香菊花多糖的提取得率增加，在90 min時(shí)提取得率達(dá)到最大值，但隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，提取得率和純度有所下降，考慮成本等因素，酶解時(shí)間選擇90 min。

2.3.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)及方差分析

在復(fù)合酶提取高寒香菊花多糖單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間以及pH值為影響因素，以提取得率和純度為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表2～表4。

圖3 時(shí)間對(duì)多糖提取得率和純度的影響

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2知，各因素對(duì)提取得率的影響順序?yàn)锳＞B＞C，即提取溫度＞pH值＞提取時(shí)間。各因素對(duì)純度的影響順序也為A＞C＞B，即提取溫度＞提取時(shí)間＞pH。比較k值的大小可以看出，高寒香菊花多糖提取工藝的優(yōu)化條件是A2B2C3及A2B1C1，分別進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，采用A2B2C3組合得到高寒香菊花多糖提取得率為9.83%，純度為28.58%;采用A2B1C1組合得到高寒香菊花多糖提取得率為9.78%，純度為28.34%，因此取 A2B2C3為最優(yōu)組合，即55℃，pH 4.5，提取時(shí)間2.0h，在此條件下得到的多糖經(jīng)聚酰胺柱純化后的純度為64.57%。而經(jīng)試驗(yàn)，用傳統(tǒng)熱水提取工藝得到金雞菊多糖的提取得率僅為3.41%，可見(jiàn)利用加酶和超聲技術(shù)可提高高寒香菊花多糖提取得率。

表3 以提取得率為考察指標(biāo)的方差分析表

表4 以純度為考察指標(biāo)的方差分析表

由表3、表4可知，提取溫度對(duì)提取得率和純度在所考察的范圍內(nèi)影響顯著，而pH值提取時(shí)間對(duì)提取得率和純度在所考察的范圍內(nèi)影響不顯著，因?yàn)槊傅谋举|(zhì)是蛋白質(zhì)，其活性受溫度的影響較大，其次pH值變化會(huì)引起其解離狀態(tài)的變化。

酸性蛋白酶對(duì)植物中的游離蛋白質(zhì)具有水解作用，可使植物結(jié)構(gòu)變得松散，同時(shí)蛋白酶還會(huì)使糖蛋白和聚糖中游離蛋白質(zhì)水解，降低了它們與原料的結(jié)合力，有利于植物多糖的浸出，但蛋白酶可分解蛋白質(zhì)，對(duì)多糖純度有一定影響。植物中纖維素含量普遍較高，纖維素酶是一種復(fù)合酶，纖維素酶可以破壞阻礙多糖溶出的細(xì)胞壁，是多糖便于溶出，縮短提取時(shí)間和周期，并將淀粉和纖維素質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)。纖維素酶和酸性蛋白酶復(fù)合可充分發(fā)揮各自的作用方式，有效增加提取得率，并縮短提取時(shí)間和周期。

2.4 加酶和超聲技術(shù)對(duì)高寒香菊花多糖結(jié)構(gòu)影響評(píng)價(jià)［9］

在500～4 000 cm－1波段范圍內(nèi)分別掃描加酶超聲處理、加酶未經(jīng)超聲處理、未經(jīng)加酶超聲處理、未加酶未經(jīng)超聲的采用不同手段提取得到的4組高寒香菊花多糖樣品，得到了4個(gè)紅外光譜譜圖，將這4個(gè)圖進(jìn)行疊加就得到4個(gè)高寒香菊花多糖紅外光譜疊加效果圖，(見(jiàn)圖4)。

由圖4可以看出，4組光譜圖的重疊效果很好，說(shuō)明四組多糖分子結(jié)構(gòu)不存在顯著差異，所以酶解和超聲技術(shù)對(duì)高寒香菊花多糖結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

圖4 四組高寒香菊花多糖紅外光譜疊加效果圖

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)得出復(fù)合酶法超聲提取高寒香菊花多糖的最佳工藝條件為:提取溫度為55℃，pH 4.5，提取時(shí)間2.0 h，在此條件下，多糖提取得率為9.83%，純度為28.58%，經(jīng)聚酰胺柱純化后多糖的純度為64.57%。采用加酶和超聲技術(shù)均可提高高寒香菊花多糖提取得率，但對(duì)高寒香菊花多糖的結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響，因此利用加酶超聲輔助提取高寒香菊花多糖手段是高效可行的。

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Optimization Techniques for the Extraction of Polysaccharides from Coreopsis basalis Flower by Ultrasound-Assisted Compound Enzymolysis

Jing Si-qun1，2，Zhang Xiao-ming1
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)2(College of Life Sciences and Technology ，Xinjiang University，Urumqi 830046 China)

With yield and purity of crude polysaccharide as evaluation indexes，the optimal extraction process conditions of polysaccharides from Coreopsis basalis flowers by ultrasoound-assisted compound enzymolysis was studied.Effect of enzymatic hydrolysis and ultrasonic treatment on the structure of Coreopsis basalis flowers polysaccharides was evaluated through the near infrared spectral analysis，no enzyme and ultrasound-assisted treatment was used as control.The results showed that the optimal extraction process conditions were:compound enzyme 2.5%(cellulase 2%，acid protease 0.5%)，temperature 55℃，pH 4.5，2.0 h.Under these conditions，the yield of crude polysaccharide was up to 9.83%，purity was 28.58%，and the purity was up to 64.57%after polyamide column purification.The result of near infrared spectral analysis showed that enzymatic hydrolysis and ultrasonic assisted extraction technology had no significant effect on the structure of Coreopsis basalis polysaccharides，but they can improve the extraction yield of polysaccharides.

compound enzyme，ultrasonic assisted extraction，Coreopsis basalis flower polysaccharide，spectroscopy analysis

碩士，副教授(張曉鳴教授為通訊作者)。

2011－07－31，改回日期:2011－11－24