金蓮花中葒草苷和牡荊苷小鼠體內(nèi)抗氧化作用研究

王治寶，袁 博，賈曉坤，安 芳

（1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口075000；2.河北省張家口市中心血站，河北 張家口075000）

金蓮花是毛茛科植物金蓮花（TrolliuschinensisBunge）的干燥花及花蕾，臨床上主要用其制劑來治療上呼吸道感染、扁桃體炎[1]等?，F(xiàn)代藥物分析研究表明，金蓮花中主要含有黃酮、多糖、色素、揮發(fā)油等化學(xué)成分。前期研究表明，金蓮花總黃酮、葒草苷和牡荊苷體外具有清除超氧陰離子、羥基自由、DPPH能力以及對紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用，葒草苷和牡荊苷在一定濃度范圍內(nèi)體外抗氧化作用均優(yōu)于金蓮花總黃酮，牡荊苷當(dāng)其濃度大于2μg·mL－1時對羥基自由基的產(chǎn)生有促進(jìn)作用[2－3]。研究表明，葒草苷和牡荊苷具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。藥代動力學(xué)研究表明，靜脈給藥后，葒草苷和牡荊苷在兔體內(nèi)腎臟中分布最多[4－5]，進(jìn)一步研究葒草苷和牡荊苷在動物體內(nèi)的抗氧化作用，初步探討其抗氧化的作用機(jī)制有積極意義。葒草苷和牡荊苷化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似（圖1），通過比較葒草苷和牡荊苷的體內(nèi)抗氧化作用，以期篩選出抗氧化作用最佳藥物的構(gòu)效關(guān)系。

圖1 葒草苷和牡荊苷結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 野生金蓮花采自河北省張家口沽源，經(jīng)河北北方學(xué)院藥物研究所鑒定為金蓮花（TrolliuschinensisBunge）。葒草苷和牡荊苷（自制，經(jīng)1H－NMR和 HPLC鑒定純度98.6%）；SOD、CAT、GSH－PX、MDA測定試劑盒均購買自南京建成生物工程研究所（批號分別為：20100610、20100810、20100823、20101208）；其它試劑均為分析純。

1.1.2 動物 健康的昆明種小鼠70只（雌雄各半），河北北方學(xué)院動物中心提供（許可證號：SCXK京2004－0001），分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃，濕度40%。

1.1.3 儀器 U－3900紫外可見分光光度計(jì)（日本）；ME235S十萬分之一電子天平（日本）；DK－8型電熱恒溫水槽（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；低溫高速離心機(jī)（賽多利斯公司）；HQ－60型旋渦混合器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司）。

1.2 方法

1.2.1 給藥與分組

葒草苷和牡荊苷溶液的配制：N，N－二甲基甲酰胺∶吐溫－80∶生理鹽水＝1∶1∶20為溶劑，按要求配制不同濃度的葒草苷和牡荊苷溶液。分為正常對照組、葒草苷和牡荊苷高、中、低各三個劑量組，各組每日上午分別給藥，正常對照組給等體積的葒草苷和牡荊苷溶劑（N，N－二甲基甲酰胺∶吐溫－80∶生理鹽水＝1∶1∶20），每日一次。以臨床維生素E給藥劑量做標(biāo)準(zhǔn)，按人與小鼠體表面積換算，確定葒草苷和牡荊苷高、中、低劑量組為40mg·kg－1，20mg·kg－1，10mg·kg－1。每天稱重一次，依據(jù)小鼠體重調(diào)整給藥劑量，給藥時間12d。

1.2.2 觀察指標(biāo)與方法

1.2.2.1 小鼠血清中SOD、CAT、GSH－PX的測定

給藥12d后，d 13，小鼠斷頭取血，以4 000r·min－1離心10min，取血清按照試劑盒上說明操作，測定SOD、CAT、GSH－PX的含量。

1.2.2.2 小鼠組織中SOD、CAT、GSH－PX、MDA的測定

迅速取出肝、腦、腎組織于冰盤中，精確稱量，用預(yù)冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿液，8 000r·min－1離心得上清液。取1.0mL的上清液，加入1.0mL乙醇－氯仿混合液（兩者體積比為5∶3），震蕩2min，4 000r·min－1離心5min以除去蛋白質(zhì)，取上清液按試劑盒說明操作，測定SOD、CAT、GSH－PX的活性及MDA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 葒草苷和牡荊苷對小鼠血清SOD、CAT、GSH－PX的影響，見表1。

表1 葒草苷和牡荊苷對小鼠血清SOD、CAT、GSH－PX的影響（±s）

表1 葒草苷和牡荊苷對小鼠血清SOD、CAT、GSH－PX的影響（±s）

注：與對照組相比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與葒草苷中劑量組相比△P＜0.05；與葒草苷低劑量組相比＃P＜0.05

分組 n SOD（U·mL－1）CAT（U·mL－1）GSH－PX（U·μL－1）10 47.22±8.1 69.15±16.42 1.63±0.08葒草苷高劑量組 10 86.81±6.7＊＊ 112.28±13.56＊＊ 4.79±0.07＊＊葒草苷中劑量組 10 73.10±6.4＊＊ 99.47±11.24＊＊ 4.04±0.06＊＊葒草苷低劑量組 10 60.98±6.2＊＊ 85.39±12.75＊＊ 3.75±0.08＊＊牡荊苷高劑量組 10 83.97±7.0＊＊ 109.20±13.91＊＊ 4.59±0.07＊＊牡荊苷中劑量組 10 62.04±5.0＊＊△ 86.34±10.27＊＊△ 3.02±0.06＊＊△牡荊苷低劑量組 10 55.26±6.1＊＃ 76.15±11.20＊＃ 2.25±0.08＊＃對照組

與正常組相比，葒草苷牡荊苷各給藥組均具有提高小鼠血清SOD、CAT、GSH－PX的作用，差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。

葒草苷中、低劑量組提高小鼠血清SOD、CAT、GSH－PX的作用高于牡荊苷同等劑量組，差異有顯著性（P＜0.05），葒草苷和牡荊苷高劑量組相比差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 葒草苷和牡荊苷對小鼠肝、腦、腎、SOD、CAT、GSH－PX、MDA的影響，結(jié)果見表2、表3。

表2 葒草苷和牡荊苷對小鼠肝、腦、腎中SOD、CAT的影響（±s）

表2 葒草苷和牡荊苷對小鼠肝、腦、腎中SOD、CAT的影響（±s）

注：與對照組相比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與葒草苷中劑量相比△P＜0.05；與葒草苷低劑量組相比＃P＜0.05

分組 n SOD（U·mL－1）CAT（U·mL－1）肝腦腎肝腦腎0.83 6.02±0.91 8.208±0.91葒草苷高劑量組10 127.24±7.82＊＊ 147.36±7.12＊＊ 134.76±6.02＊＊ 9.20±0.78＊＊ 9.84±0.71＊＊ 12.48±0.60＊＊葒草苷中劑量組10 111.23±7.06＊＊ 129.36±7.04＊＊ 117.36±7.59＊ 8.23±0.71＊＊ 8.94±0.70＊＊ 10.24±0.76＊＊葒草苷低劑量組10 102.14±8.07＊ 119.36±6.89＊ 112.32±6.34＊ 7.71±0.81＊ 7.96±0.68＊ 9.64±0.64＊牡荊苷高劑量組10 124.01±7.72＊＊ 138.36±8.01＊＊ 127.24±6.86＊＊ 8.90±0.78＊＊ 9.34±0.71＊＊ 11.78±0.61＊＊牡荊苷中劑量組10 100.23±6.76＊△ 119.36±7.06＊△ 110.36±7.63＊△ 7.93±0.69＊△ 7.94±0.68＊△ 9.24±0.72＊△牡荊苷低劑量組10 95.14±7.77＃ 111.36±7.67＃ 102.32±6.55＃ 6.71±0.86＃ 6.86±0.76＊＃ 8.62±0.70＊＃對照組 10 92.17±8.26 110.24±9.08 100.08±9.15 6.52±

表3 葒草苷和牡荊苷對小鼠肝、腦、腎中GSH－PX、MDA的影響（±s）

表3 葒草苷和牡荊苷對小鼠肝、腦、腎中GSH－PX、MDA的影響（±s）

注：與對照組相比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與葒草苷中劑量組相比△P＜0.05；與葒草苷低劑量組相比＃P＜0.05

分組 n GSH－PX（U·μL－1）MDA（nmol·mL－1）肝腦腎肝腦腎.26 8.48±2.37 15.17±3.64葒草苷高劑量組10 49.88±1.16＊＊ 33.34±1.69＊＊ 53.42±1.96＊＊ 9.35±2.58＊＊ 5.22±3.76＊＊ 8.10±3.09＊＊葒草苷中劑量組10 42.32±1.18＊＊ 27.40±1.37＊＊ 45.24±1.04＊＊ 10.71±2.02＊＊ 6.25±2.63＊＊ 11.56±2.54＊＊葒草苷低劑量組10 37.93±1.20＊ 23.56±2.14＊ 40.21±1.94＊ 12.32±4.01＊ 7.69±3.59＊ 13.65±3.65＊牡荊苷高劑量組10 47.57±0.94＊＊ 33.02±2.03＊＊ 52.46±1.02＊＊ 9.69±3.61＊＊ 6.01±3.24＊＊ 8.96±2.58＊＊牡荊苷中劑量組10 37.16±1.06＊△ 22.93±1.97＊△ 39.926±1.65＊△ 11.24±2.97＊△ 7.03±3.06＊△ 12.87±3.52＊△牡荊苷低劑量組10 36.04±1.68＊＃ 20.96±1.21＊＃ 31.64±1.29＊＃ 13.04±2.43＊＃ 7.45±2.52＊＃ 11.46±2.83＊＃對照組 10 32.46±1.10 16.58±2.05 34.56±1.12 15.52±3

與正常組相比，葒草苷和牡荊苷各給藥組均具有提高小鼠肝、腦、腎組織中SOD、CAT、GSH－PX含量，明顯降低MDA含量，差異具有顯著性（P＜0.01）。

葒草苷中、低劑量組提高小鼠肝、腦、腎組織中SOD、CAT、GSH－PX的作用和降低MDA的作用高于牡荊苷中、低劑量組，差異具有顯著性（P＜0.05）；葒草苷與牡荊苷的高劑量組差異無顯著性。

3 討 論

在正常代謝情況下，機(jī)體產(chǎn)生和清除自由基處于一種動態(tài)平衡中，內(nèi)源性的清除自由基的酶系有SOD、CAT、GSH－PX等，外源性的清除劑有維生素E、維生素C以及從植物提取出的黃酮類等化合物。SOD可以催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，產(chǎn)生破壞能力相對較低的H2O2，而CAT和GSH－PX能將H2O2分解成H2O和O2，減輕或阻斷脂質(zhì)過氧化作用的一級引發(fā)作用，保護(hù)機(jī)體免受過氧化氫的侵害，延緩細(xì)胞的衰老，從而預(yù)防自由基導(dǎo)致的疾病的發(fā)生[6]。根據(jù)自由基學(xué)說，適當(dāng)補(bǔ)充外源性自由基清除劑，增強(qiáng)肌體自由基防御系統(tǒng)能力，即可達(dá)到抗衰老的目的。MDA是氧自由基引起細(xì)胞膜不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化損傷的終產(chǎn)物，是極其活潑的交聯(lián)劑，能與蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)，從而使細(xì)胞變性甚至失活，MDA可反映機(jī)體內(nèi)過氧化程度，間接反映出細(xì)胞的受損程度[7]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葒草苷和牡荊苷在提高機(jī)體內(nèi)SOD、CAT、GSH－PX的活性方面發(fā)揮較好的作用，且葒草苷和牡荊苷均能降低組織內(nèi)的MDA的含量，提示葒草苷和牡荊苷可能通過直接清除體內(nèi)氧自由基，激活抗氧化酶系的防御系統(tǒng)等作用，提高機(jī)體的抗氧化能力，減少自由基對機(jī)體的損傷，從而起到延緩衰老的作用。其中葒草苷中、低劑量組提高機(jī)體抗氧化酶和降低組織MDA的作用分別比牡荊苷中、低劑量組的作用強(qiáng)，這與文獻(xiàn)所說B環(huán)上具有鄰二酚羥基的黃酮抗氧化活性要比B環(huán)上連有一個酚羥基的黃酮抗氧化性強(qiáng)相一致[8]。

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[4]曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內(nèi)藥代動力學(xué)研究 [D].河北北方學(xué)院.2010.

[5]顏娟.金蓮花中牡荊苷兔體內(nèi)藥代動力學(xué)研究 [D].河北北方學(xué)院.2010.

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[8]劉利華，宛曉春.黃酮類化合物抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展 [J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，29（3）：265－267.