胰高血糖素樣肽1及其受體激動劑研究進展*

付 剛 龔 珉 徐為人

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種慢性高血糖綜合征，其中2型糖尿?。═2DM）占糖尿病患者群體的90%以上。世界衛(wèi)生組織預測，到2030年，全球T2DM患者的數(shù)量將超過3億[1]。目前，常規(guī)治療T2DM的藥物包括胰島素、雙胍類、磺酰脲類以及噻唑啉二酮類。然而這些藥物很少能長效控制血糖水平，且存在致低血糖、浮腫及體質(zhì)量增加等不良反映。胰高血糖素樣肽（glucagon-like peptide，GLP）-1是一種由腸L細胞分泌的腸促胰島素，具有促進胰島素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌、促進胰島細胞增殖等多種生理功能，具有良好的藥物應用前景。

1 GLP-1的發(fā)現(xiàn)

人進食后會通過神經(jīng)和激素信號激活一系列生理反應，從而調(diào)節(jié)消化和吸收過程，其中腸促胰島素在此過程中起重要作用。腸促胰島素的概念由Murce于20世紀初提出，1973年分離純化出第1個腸促胰島素—葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）。GIP主要由近端小腸K細胞合成并分泌，由42個氨基酸組成，多集中在十二指腸和上部空腸，能促進胰島細胞分泌胰島素。后來人們發(fā)現(xiàn)了第2種腸促胰島素多肽—GLP。GLP-1的發(fā)現(xiàn)源于對胰高血糖素原（proglucagon，PG）基因序列的分析，胰高血糖素原基因序列由6個外顯子和5個內(nèi)顯子組成，含有3個主要的結(jié)構(gòu)域：胰高血糖素（PG33～61）、GLP-1（PG72～108）和GLP-2（PG126～158）。PG基因在胰島α細胞、腸L細胞及部分神經(jīng)細胞中表達，通過組織特異性翻譯后修飾，從而在不同組織結(jié)構(gòu)中形成不同的最終產(chǎn)物，見圖1。GLP有GLP-1和GLP-2兩種亞型，GLP-1是由末端空腸、回腸和結(jié)腸的朗格漢斯細胞分泌的一種多肽激素，具有葡萄糖依賴性的促進胰島素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素的分泌及抑制胃排空等多種功能；GLP-2能促進正常小腸的生長和發(fā)育，保護和修復各種腸道疾病中損傷的腸黏膜，抑制胃酸的分泌和胃腸的運動，增加腸道的血液供應等。

2 GLP-1的結(jié)構(gòu)及生理功能

GLP-1（1-37）由胰高血糖素基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剪切后表達生成，但其并非人體內(nèi)的活性形式，N端截短的GLP-1（7-36或7-37）是循環(huán)中的主要活性形式，其中GLP-1（7-36）約占80%[2]，此后絕大多數(shù)GLP-1類似物的開發(fā)也是基于此種截短序列。GLP-1的N端區(qū)域和受體結(jié)合能力相關(guān)，尤其是 His7、Gly10、Thr13及 Asp15直接與受體結(jié)合，His7的喪失會導致GLP-1完全失去生物活性，同樣C端氨基酸殘基喪失也會導致GLP-1生物活性明顯下降。GLP-1的主要生理功能包括葡萄糖依賴性的促進胰島素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素的分泌，促進胰島β細胞增殖，抑制胰島β細胞凋亡，保存β細胞對血糖的敏感性，抑制胃腸道蠕動和胃液分泌，延遲胃排空等。GLP-1也能直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘導神經(jīng)復合體產(chǎn)生飽腹感，從而降低食欲，抑制食物的攝取。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還能降低心收縮壓（SBP），減少血液中三酰甘油、纖維蛋白溶酶原激活抑制子-1（PAI-1）和B型腦鈉肽（BNP）的濃度，具有一定保護心血管的功能[3]。另外，動物實驗表明GLP-1能夠防止心肌細胞缺血，保護內(nèi)皮細胞功能和利尿等功能[4]。

GLP-1的分泌基于機體對能量的攝入，包括糖類、脂肪酸以及少量氨基酸[5]。有研究顯示，GLP-1的分泌與細胞內(nèi)ATP的生成、KATP通道的阻塞以及細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加有關(guān)[6]。另有研究則表明，在小鼠體內(nèi)一些神經(jīng)內(nèi)分泌多肽通過迷走神經(jīng)參與了GLP-1的分泌[7]。但目前對于人體內(nèi)GLP-1的快速響應性分泌機制尚不確定。

GLP-1通過與其在β細胞上的特異性受體GLP-1R相結(jié)合發(fā)揮相應的生理作用，其受體屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）B家族。GLP-1R包括1個胞外N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NT）、3個胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（EC1-3）、3個胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（IC1-3）、7個跨膜核心結(jié)構(gòu)域（TM1-7）及胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域（CT）。根據(jù)多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域模型分析結(jié)果[8]，NT結(jié)構(gòu)域主要負責提供多肽結(jié)合所需的能量，而核心結(jié)構(gòu)域TM1-7負責結(jié)合配體的N端并將信號傳遞至細胞內(nèi)的G蛋白。GLP-1受體與其配體的結(jié)合機制不是單一的，根據(jù)體外表達GLP-1R全長和NT結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合結(jié)果，GLP-1R的NT結(jié)構(gòu)域（Ala21-Leu144）與GLP-1的結(jié)合能力很差，卻能和Exendin-4正常結(jié)合，表明2種多肽與GLP-1R的結(jié)合機制不同，Exendin-4與GLP-1R的結(jié)合更多的依賴于NT結(jié)構(gòu)域，而GLP-1與GLP-1R的結(jié)合與TM核心結(jié)構(gòu)域關(guān)系緊密。GLP-1R在胰島細胞中高度表達，通過原位雜交和免疫組化實驗證實GLP-1R在胰島中主要存在于β細胞，在α細胞和δ細胞中表達較少[9]。除胰腺外，GLP-1R在腸、心臟、腦、肺及腎臟等組織中都有廣泛分布，用125I標記的GLP-1（7-36）對人組織切片進行的放射自顯影實驗發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)中的GLP-1R含量很高，表明這些受體可能通過改變葡萄糖敏感性參與葡萄糖的代謝調(diào)節(jié)[10]。

GLP-1R激活后會增加細胞內(nèi)cAMP濃度并激活蛋白激酶A（PKA），通過cAMP/PKA激酶通路增強β細胞內(nèi)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并提高對葡萄糖刺激信號的敏感性，從而增加胰島素分泌量[11]。Pdx-1基因?qū)σ葝u細胞增長和胰島細胞基因轉(zhuǎn)錄具有重要作用，實驗證實用GLP-1及其類似物注射大鼠和兔子能夠增加Pdx-1基因的表達水平[12]。GLP-1還通過與α細胞上的GLP-1R作用抑制胰高血糖素的分泌[13]，或者間接通過促進胰島素和生長抑素的分泌來抑制胰高血糖素的分泌[14]。GLP-1對于調(diào)節(jié)胃排空速率和餐后血糖濃度的動態(tài)平衡可能是通過迷走神經(jīng)起作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1及其類似物能夠抑制胰島β細胞的凋亡，用GLP-1與人胰島細胞共同孵育能夠降低細胞內(nèi)凋亡基因的表達，抑制其死亡，動物實驗也證實在Zucker和db/db小鼠體內(nèi)注射GLP-1后，β細胞的凋亡數(shù)量比對照組減少了20%[16]。GLP-1在體內(nèi)能夠迅速地被二肽基肽酶4（DPP4）所降解而失去活性，見圖2，這是造成其半衰期縮短（約2 min）的直接原因。DPP4能夠識別并特異性切割GLP-1 N端的丙氨酸，造成GLP-1由活性形式GLP-1（7-37）變?yōu)槭Щ钚问紾LP-1（9-37）。而且由于其失活形式在體內(nèi)的代謝速率較慢，GLP-1與活性形式的GLP-1（7-37）競爭性的與GLP-1R相結(jié)合，對胰島素分泌和釋放產(chǎn)生不利作用。另外，一種結(jié)合于膜上的鋅金屬肽酶NEP 24.11也能于6個可能的識別位點上降解GLP-1[17]，這種酶在腎臟中高度表達，而腎臟也是GLP-1被快速代謝而失活的重要場所[18]。據(jù)此可推斷，NEP 24.11也參與了GLP-1的體內(nèi)代謝。

3 GLP-1受體激動劑

3.1 艾賽那肽（Exenatide） 艾賽那肽是由美國Amylin公司和Lilly公司聯(lián)合研制的基于Exendin-4的化學合成多肽，商品名為百泌達。Exendin-4是從毒蜥唾液中分離得到的一種多肽類物質(zhì)，全長39個氨基酸，比GLP-1多9個氨基酸，見圖3。艾賽那肽與GLP-1有53%的同源性，N端的同源性更是高達80%。該多肽與GLP-1有同樣的促胰島素分泌的作用，相比原生GLP-1，其與GLP-1R有很強的結(jié)合能力（大于1 000倍）。由于Exendin-4 N端的第2個氨基酸為甘氨酸，能夠耐受血漿中DPP-IV的分解，C端比GLP-1多9個氨基酸，不易被肽鏈內(nèi)切酶降解，所以其穩(wěn)定性遠高于GLP-1。艾賽那肽同樣具有葡萄糖依賴性促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及減慢胃排空等生理功能，其血漿半衰期長達60～90 min。2005年被美國和歐洲批準用于口服二甲雙胍等糖尿病藥物無效的T2DM患者的輔助治療，給藥方式為每2 d 1次。艾賽那肽能夠顯著降低患者的糖化血紅蛋白（HbA1c），調(diào)節(jié)餐后及空腹血糖水平，增強胰島β細胞功能，降低體質(zhì)量[19]，且不會引起血糖過低。臨床數(shù)據(jù)顯示，2次/d注射10 mg艾賽那肽患者的HbA1c水平降低了0.8%～0.9%；2次/d注射5 mg艾賽那肽患者的HbA1c水平降低了0.4%～0.6%；安慰劑組患者的HbA1c水平上升了0.1%～0.2%[20]。1項為期3年的跟蹤研究結(jié)果顯示，2次/d注射10μg艾賽那肽的患者，其HbA1c水平一直保有1.0%左右的降低水平，46%患者的HbA1c水平始終保持在7%的降低水平以下，3年內(nèi)體質(zhì)量平均降低5.3 kg[21]。艾賽那肽還顯示出與胰島素的協(xié)同作用，實驗證實注射艾賽那肽的患者降低了對速效胰島素的需求量[22]。盡管如此，臨床實驗顯示其仍具有一定的不適反應，如惡心（57%）、嘔吐（17%）等，降低藥量并持續(xù)治療后癥狀減輕；有極少數(shù)患者產(chǎn)生胰腺炎等嚴重不良反應，但并沒有直接證據(jù)證明其與艾賽那肽有直接關(guān)系[23]。

3.2 艾賽那肽LAR 艾賽那肽LAR是由Amylin，Alkermes和EliLilly公司共同開發(fā)的一種由聚合物微球包裹的Exena?tide長效釋放制劑，目前在美國和加拿大已進入Ⅲ期臨床研究階段，給藥方式為每周皮下注射1次。其采用多聚乳酸-羥基乙酸與艾賽那肽混合而成，這種微球顆?？杀蝗梭w自然降解，是一種用于緩釋藥物的成分，見圖3。包裹后的艾賽那肽表現(xiàn)出24 h緩釋效果，全天都能檢測到血液中治療濃度的藥物。根據(jù)一項295例患者參與的長達30周的隨機對照實驗結(jié)果，一周注射2 mg艾賽那肽LAR的患者與2次/d注射10 μg艾賽那肽的患者相比，艾賽那肽LAR能夠更有效的降低HbA1c（1.9%vs 1.5%）并降低體質(zhì)量（3.7 kg vs3.6 kg）[24]。然而一項30周的隨機對照研究顯示[25]，艾賽那肽LAR與艾賽那肽相比，惡心（26%vs35%）和嘔吐（11%vs19%）等典型不良反應降低，但是抗體產(chǎn)生概率高于艾賽那肽，且注射部位瘙癢現(xiàn)象也更為明顯（18%vs1%）。

3.3 利拉魯肽（Liraglutide） 利拉魯肽又叫做NN2211，由諾和諾德公司研發(fā)，其氨基酸序列與人GLP-1具有97%的同源性，其34位的賴氨酸被精氨酸取代，并在26位賴氨酸上經(jīng)由γ-谷氨酸連接上了1個16碳脂肪酸，該脂肪酸能在進入血漿后與白蛋白形成非共價結(jié)合，見圖3，使利拉魯肽抵抗DPP4的降解作用，同時起到緩釋作用，半衰期為10～14 h，給藥方式為1次/d。另外利拉魯肽還能在注射點形成微團樣聚集物，從而降低對DPP4降解的分子易感性[26]。一項超過4 000名患者參與的Ⅲ期臨床實驗表明，單用1.2 mg和1.8 mg利拉魯肽比格列美脲（8 mg）等口服降糖藥能夠更明顯地降低患者的HbA1c、空腹及餐后血糖，并減輕體質(zhì)量[27]。另有實驗證實利拉魯肽比GLP-1能夠更明顯的抑制β細胞的凋亡[28]，也能增加人β細胞的功能[29]，增加胰島素的生物合成[30]。此外其還可以控制患者收縮壓，調(diào)節(jié)心血管功能[31]。利拉魯肽的不良反應包括惡心、嘔吐和輕微頭痛，三分之二的患者在1～3 d內(nèi)癥狀消失。利拉魯肽與艾賽那肽相比有更低的抗體反應，這可能是由于其與艾賽那肽相比，利拉魯肽與原生GLP-1有較高的同源性。

3.4 CJC-1131 CJC-1131是由ConjuChem公司利用其專利技術(shù)“藥物親和復合體”（drug affinity complex，DAC）開發(fā)的一種GLP-1類似物，其C末端具有一個化學合成的連接子，皮下注射后可以與人血清白蛋白34位的賴氨酸共價結(jié)合，并能夠耐受DPP4的降解，體內(nèi)半衰期較長（健康人約為8.9～14.7 d；T2DM患者約為9.1～13.8 d），目前處于Ⅲ期臨床階段。臨床數(shù)據(jù)顯示其能夠降低患者血糖和體質(zhì)量，體外實驗證實其能夠增加cAMP水平，不良反應包括惡心、嘔吐，多發(fā)生在給藥后。

3.5 其他GLP-1受體激動劑 除上述GLP-1受體激動劑外，還有一些處于研發(fā)及早期臨床階段的GLP-1受體激動劑，這些新的激動劑有望在延長半衰期的同時進一步減輕胃腸不良反應。LY2189265是一種GLP-1類似物與Fc片段的融合蛋白，LY2428757是一種聚乙二醇GLP-1類似物，給藥周期都達到了1周1次，二者分別處于Ⅱ期和Ⅲ期臨床階段。CJC-1134-PC是Exendin-4與人血清白蛋白的融合蛋白，半衰期約為8 d；葛蘭素史克研發(fā)的Albiglutide也是GLP-1與白蛋白的復合物，正處于Ⅲ期臨床階段，二者給藥周期都達到了1周1次。Semaglutide（NN9535）是諾和諾德公司研發(fā)的另一長效GLP-1類似物，已完成Ⅱ期臨床試驗，預計給藥周期為1周1次[32]。同時諾和諾德公司還在研發(fā)口服型GLP-1類似物（NN9924）以增加患者適用度，計劃于2011年1月進入Ⅰ期臨床試驗[33]。另外，關(guān)于GLP-1受體的小分子激動劑也在研究之中。2007年Chen等[34]通過高通量篩選方法獲得的取代環(huán)丁烷Boc5具有較好的降糖作用，其能夠促進分離大鼠胰島中葡萄糖刺激的胰島素分泌，降低ob/ob小鼠糖化血紅蛋白，降低進食量，并且這些作用均能被GLP-1降解產(chǎn)物GLP-1（9-39）競爭性抑制，提示它可能是一種非肽類GLP-1受體激動劑。Murphy等[35]發(fā)現(xiàn)另外一種GLP-1R小分子激動劑Cpd1能夠與GLP-1R結(jié)合，且不被GLP-1類似物競爭性抑制，推測其可能結(jié)合于GLP-1R活性中心外并激活受體，同時增加GLP-1與受體的親和力。Boc5等化合物的出現(xiàn)有可能會對GLP-1受體激動劑的研發(fā)開拓新思路。

4 GLP-1受體激動劑的局限性

GLP-1及其類似物的相關(guān)研發(fā)雖然已經(jīng)取得了不錯的進展，多種類似物也進入了臨床試驗階段，然而由于多肽類藥物具有一個共同的弊端，即不能口服給藥，只能通過皮下注射，因此對于長期用藥的T2DM患者來說其依從性仍舊不高。而且由于多肽類藥物的特性，其穩(wěn)定性依賴于時間、溫度及pH值，如何保證這些GLP-1類似物的活性將會是個問題（雖然艾賽那肽和利拉魯肽未出現(xiàn)穩(wěn)定性相關(guān)報道）。另外，由于這些激動劑都為人體引入了外源蛋白，可能會引發(fā)機體的免疫反應。

5 展望

GLP-1及其受體激動劑所具有的諸如葡萄糖依賴性的促進胰島素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素的分泌、促進胰島β細胞增殖、抑制胰島β細胞凋亡、保存β細胞對血糖的敏感性、抑制胃腸道蠕動和胃液分泌、延遲胃排空等多種生理學特性，以及其較少的不良反應使得其成為治療T2DM的核心藥物，近幾年各大藥物研發(fā)公司都在努力開發(fā)新的GLP-1受體激動劑。相信在不久的未來，必將出現(xiàn)更多更好的治療T2DM的GLP-1受體激動劑藥物，造福廣大T2DM患者。

Figure1 Pruduct after Translation of Proglucagon Genein Different Tissue圖1 胰高血糖素原基因在不同組織中的翻譯后產(chǎn)物

Figure2 Schemeof GLP-1 degradation and inactivation by DPP4(A)and recognition siteof NEP24.11 in GLP-1(7-36)(B)圖2 A:GLP-1被DPP4降解而失活；B:NEP24.11對GLP-1（7-36）的識別位點

Figure3 Structuresof human GLP-1,liraglutide,exenatideand exenatide-LAR圖3 人GLP-1、利拉魯肽、艾賽那肽及艾賽那肽LAR的結(jié)構(gòu)

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