血小板微顆粒對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響*

解 暢 李曦銘 賈紅丹 張迎怡 毛用敏 崔讓莊 叢洪良

血小板微顆粒（platelet microparticles，PMPs）是血小板活化后脫落的一種膜顆粒，也是血小板活化的標(biāo)志之一。以往的研究顯示PMPs參與以血管和血管發(fā)生為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的增殖，抑制其凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和生長，對于新生血管的形成有重要作用[1]。然而對PMPs誘導(dǎo)血管發(fā)生及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制研究甚少，對PMPs與內(nèi)皮細(xì)胞作用的形式及下游轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑闡述多屬間接。本實驗應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)從富含血小板的血漿中提取高純度的PMPs，研究不同濃度PMPs及其與細(xì)胞作用不同時間對內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、其Ⅱ型受體KDR及其下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要酶的差異，探討PMPs影響內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)及新生血管形成的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系由天津市心血管病學(xué)研究所提供。流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur）及CD61a-FITC抗體購自美國BD公司；直徑1 μm的標(biāo)準(zhǔn)微球購自Sigma公司。UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒及實驗所需引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）復(fù)蘇，在37℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)，實驗采用3～4代細(xì)胞；按1×105/mL密度接種于9.6 cm2的6孔板中，生長接近100%時，進(jìn)行PMPs的干預(yù)。提取PMPs的枸櫞酸鈉抗凝靜脈血均來源于天津市胸科醫(yī)院檢驗科，征得所有患者同意并簽署知情同意書。

1.2 PMPs的提取 枸櫞酸鈉抗凝靜脈血，800 r/min離心10 min，去除血細(xì)胞，上清為富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）。3 000 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀為血小板，每管中加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、5 μL100 mmol/L Ca2+、200 mmol/L Mg2+懸浮混勻血小板。在不同血小板懸濁液中分別加入不同濃度的凝血酶和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP），通過預(yù)實驗，本實驗最終選用10 μmol/L ADP為激活劑，激活血小板，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測，比較血小板釋放PMPs數(shù)量，另設(shè)一管為對照管，不加入激活劑。共同37℃水浴20 min。4 600 r/min離心30 min，去除血小板凝聚物。將其上清液13 000 r/min離心60 min，得到去除血小板后純化的PMPs沉淀，用0.5 mL1×Tyrode’s Buffer懸浮。所得懸濁液中均加入20 μL CD61a-FITC抗體（為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的整合素b3型抗體，結(jié)合位點位于GPⅢα，購自Becton Drive公司），避光20 min上流式細(xì)胞儀檢測，并據(jù)此設(shè)定流式細(xì)胞儀檢測PMPs的各項參數(shù)及設(shè)門。

1.3 不同濃度PMPs干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730 按參考文獻(xiàn)[1]方法配制PMPs不同干預(yù)濃度。選用DMEM/F12(購自GIBCO公司)完全培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈霉素，在95%空氣和5%CO2混合氣體中常規(guī)培養(yǎng)。后以每孔CRL-1730細(xì)胞量為1×106分入9.6 cm2的6孔板中，24 h后換液，生長接近100%時，即內(nèi)皮細(xì)胞約數(shù)為2.5×106時進(jìn)行PMPs的干預(yù)。選取0、10、30、50、100 mg/L 5種不同干預(yù)濃度的PMPs作用于HUVECs，每個濃度4孔細(xì)胞樣本。將配制好的不同干預(yù)濃度的PMPs懸濁液每孔1 mL加入內(nèi)皮細(xì)胞中。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。4 h后以0.5 mL PBS洗滌細(xì)胞，吸去PBS，加入0.5 mL 0.05%胰酶，37℃5%CO2培養(yǎng)箱保溫4～5 min，吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，10 000 r/min離心3 min，棄上清，1 mL PBS洗細(xì)胞2次（每次離心10 000 r/min，3 min），離心獲得干預(yù)后的內(nèi)皮細(xì)胞，-80℃凍存。

1.4 不同時間PMPs作用內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730 PMPs濃度采取50 mg/L，每一作用時間共4孔細(xì)胞樣本，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中分別孵育0、2、4、24 h。分別收集不同作用時間的細(xì)胞，步驟方法同前。

1.5 RT-PCR檢測 應(yīng)用UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒提取上述制備好的凍存的HUVECs中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。VEGF、其受體KDR及其下游傳導(dǎo)通路中重要酶磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）以及胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）4種目的基因引物，見表1。PCR擴(kuò)增其產(chǎn)物，觀察內(nèi)皮細(xì)胞中4種因子mRNA的表達(dá)情況。瓊脂糖凝膠平板電泳法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用GEL-PRO凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描，測量目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶的灰度值及比值。

Table 1 Gene primer design and length表1 目的基因引物設(shè)計及長度

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s）表示，多組均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PMPs干預(yù)對CRL-1730 VEGF121、KDR、ERK、PI3K mRNA表達(dá)的影響 與0 mg/L組比較，不同干預(yù)濃度的PMPs均可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121mRNA的表達(dá)（均P<0.05），增加內(nèi)皮細(xì)胞KDR mRNA的表達(dá)（均P<0.05），ERK mRNA表達(dá)水平在PMPs 50 mg/L組顯著高于0 mg/L組（P=0.004），PI3K mRNA表達(dá)水平在PMPs100 mg/L組顯著高于0 mg/L組（P=0.004），見表2、圖1。

Table 2 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in endothelial cells intervened with different concentrations of PMPs表2 不同濃度PMPs對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達(dá)影響的比較 （±s）

Table 2 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in endothelial cells intervened with different concentrations of PMPs表2 不同濃度PMPs對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達(dá)影響的比較 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

PMPs濃度干預(yù)組0 mg/L（1）10 mg/L（2）30 mg/L（3）50 mg/L（4）100 mg/L（5）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）VEGF121 0.746±0.179 0.486±0.055 0.539±0.089 0.533±0.062 0.399±0.105 6.047**0.003 0.015 0.013<0.001 KDR 0.451±0.072 0.623±0.104 0.615±0.120 0.633±0.063 0.750±0.141 4.200*0.034 0.041 0.026 0.001 ERK 0.749±0.205 0.829±0.190 0.778±0.238 1.141±0.093 0.961±0.103 3.327*0.505 0.809 0.004 0.121 PI3K 0.999±0.246 0.972±0.063 0.960±0.102 1.087±0.116 1.344±0.133 4.831*0.800 0.707 0.405 0.004

Figure 1 VEGF121，KDR，ERK and PI3K mRNA expression measured by RT-PCR圖1VEGF121、KDR、ERK、PI3K的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 PMPs干預(yù)不同時間對CRL-1730 VEGF121、KDR、ERK、PI3K mRNA表達(dá)的影響 干預(yù)4、24 h后與0 h組比較VEGF121表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），而PMPs作用4 h、24 h卻可增加KDR mRNA的表達(dá)（均P<0.05）。PMPs作用于內(nèi)皮細(xì)胞24 h后與0 h組比較可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞PI3K mRNA的表達(dá)（P=0.004），見表3、圖2。

Table 3 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in the endothelial cells with different intervention times表3 不同干預(yù)時間PMPs對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達(dá)影響的比較 （±s）

Table 3 Comparison of VEGF121,KDR,ERK and PI3K mRNA expression in the endothelial cells with different intervention times表3 不同干預(yù)時間PMPs對內(nèi)皮細(xì)胞VEGF121、KDR、ERK及PI3K mRNA表達(dá)影響的比較 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

PMPs時間干預(yù)組0 h（1）2 h（2）4 h（3）24 h（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）VEGF121 0.746±0.179 0.669±0.060 0.530±0.123 0.318±0.091 9.320**0.380 0.023<0.001 KDR 0.451±0.072 0.580±0.087 0.637±0.063 0.634±0.135 3.710*0.064 0.013 0.021 ERK 0.749±0.206 0.800±0.146 0.978±0.136 0.562±0.206 3.577*0.667 0.071 0.132 PI3K 0.999±0.246 0.762±0.092 1.294±0.495 2.622±1.213 6.359**0.585 0.497 0.004

Figure 2 VEGF121，KDR，ERK and PI3K mRNA expression measured by RT-PCR圖2 VEGF121、KDR、ERK及PI3K的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

PMPs是血小板被活化后釋放的微小顆粒，透射電鏡觀察PMP為直徑0.1～1.0 μm的小囊泡[2]。此微粒包括血小板表面蛋白質(zhì)類及來源于血小板的部分胞質(zhì)成分，均為有生物學(xué)活性的物質(zhì)[3]，除凝血相關(guān)作用外，還可通過與靶細(xì)胞的相互作用啟動靶細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。VEGF是最有力的血管生成因子，它通過和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，具有強(qiáng)大的促內(nèi)皮增殖、促血管生成作用，此外其還是一種趨化因子，使外向生長內(nèi)皮細(xì)胞歸巢到血管損傷部位，修復(fù)損傷的血管[4]。Kim等[5]也證實了PMPs在體外有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、趨化和血管形成的功能。

Brill等[1]對PMPs促血管形成等進(jìn)行了研究，主動脈環(huán)實驗顯示，在PMPs 30 mg/L時新血管萌芽的面積明顯高于對照組；PMPs50 mg/L及更高濃度時其誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管萌芽面積與VEGF和bFGF誘導(dǎo)的血管面積相一致，進(jìn)一步實驗顯示加入VEGF受體抑制劑可完全抑制PMPs所引起的新生血管萌芽（0.7 mm2vs 5.3 mm2），bFGF和PDGF中和抗體只能部分抑制新生血管形成（1.7 mm2vs 2.4 mm2），因此其認(rèn)為PMPs促進(jìn)新生血管形成過程中多種細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用，其中VEGF是關(guān)鍵因子。Brill等[1]也對PMP促血管生成的傳導(dǎo)通路進(jìn)行了研究，認(rèn)為至少有3個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子是PMPs作用的關(guān)鍵點：Scr、PI3K和ERK，PMP內(nèi)的細(xì)胞因子啟動了血管內(nèi)皮細(xì)胞中的特殊信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)細(xì)胞增殖、移動和血管形成。

本研究與Brill等的實驗結(jié)論基本一致。在本研究中，采用了不同濃度PMPs對HUVECs進(jìn)行刺激，結(jié)果顯示在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入PMPs進(jìn)行刺激，細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平逐漸下降，與0 mg/L組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。50 mg/L PMPs刺激0、2、4、24 h，內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)量隨時間延長逐漸下降，即內(nèi)皮細(xì)胞自身的VEGF mRNA表達(dá)可能受到負(fù)反饋抑制而減少，而內(nèi)皮細(xì)胞VEGFⅡ型受體（KDR）mRNA表達(dá)隨PMPs干預(yù)濃度上升明顯增加，VEGF下游兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的兩個關(guān)鍵酶PI3K及ERK mRNA表達(dá)也隨PMPs濃度和時間的增加逐漸增高，表明被激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游配體VEGF可能不是來源于內(nèi)皮細(xì)胞自身，而是來源于PMPs自身所釋放的。并且已有文獻(xiàn)證實，活化后的血小板微顆粒PMPs可以釋放血管內(nèi)皮生長因子VEGF和成纖維細(xì)胞生長因子bFGF[6]，這可能是PMPs能夠啟動VEGF這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的主要原因。最近的研究也證實，血管生成因子(VEGF和FGF-2)的水平和PMPs水平有著很強(qiáng)的相關(guān)性[7]。

PMPs是血小板脫落的膜顆粒，此微粒包含了血小板表面蛋白質(zhì)類及來源血小板的部分胞質(zhì)成分，PMPs可以介導(dǎo)血管原性的應(yīng)答，來源于血小板微顆粒的多種細(xì)胞因子，如VEGF、堿性成纖維生長因子（bFGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）參與了血管的發(fā)生。隨著PMPs濃度的增加，VEGF釋放可能也隨之增加，VEGF與受體KDR結(jié)合后與PMPs未干預(yù)時比較可以顯著激活下游的PI3K/Akt和Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]，VEGF下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K和Ras途徑中的兩個關(guān)鍵酶PI3K及ERK mRNA表達(dá)也明顯升高，即PMPs可能通過PI3K/Akt及MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的增殖，抑制其調(diào)亡，參與以血管和血管發(fā)生為基礎(chǔ)的生物學(xué)過程。PMPs與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、尿毒癥、腫瘤、2型糖尿病、冠心病[9-10]等許多種疾病密切相關(guān)，其中很多機(jī)制與PMPs促進(jìn)血管新生有關(guān)，深入研究必將對臨床相關(guān)疾病的治療起到一定作用。

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