N-乙酰半胱氨酸對體外循環(huán)致大鼠腦損傷的保護作用*

曹惠鵑 周 錦 張鐵錚 孫瑩杰 姚 婧

體外循環(huán)（CPB）繼發(fā)腦損傷的原因包括CPB期間的低溫、低灌注狀態(tài)，非搏動血流，炎性介質及血管內微栓等。這些因素共同作用，促進了CPB期間腦缺氧/缺血和全身炎癥反應，導致氧自由基形成過多和抗氧化物質的損耗。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是細胞維持正常生理功能的重要化合物——谷胱甘肽（GSH）的前體物質，對氧化應激、缺血-再灌注損傷等有一定的防治作用。本研究通過建立大鼠CPB模型，觀察NAC對CPB大鼠血漿腦損傷標志物、炎性因子及海馬區(qū)神經元超微結構的影響，探討NAC對CPB致大鼠腦損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 24只健康雄性清潔級SD大鼠，4～6個月齡，體質量300～400 g，購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。按隨機數(shù)字表分為假手術組（S組）、CPB組（C組）、CPB+NAC組（N組），每組8只。S組僅置管，不進行CPB；C組和N組進行CPB 1 h，然后觀察2 h。N組在預充液中加入NAC（美國Sigma公司，批號A-7250）100 mg/kg，然后以20 mg/（kg·h）速度輸注1 h直到停轉流，C組輸注等容量生理鹽水。

1.2 CPB模型建立與標本采集 24只大鼠在實驗前禁食水6 h，腹腔內注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，窺喉后經口氣管插管，接TKR200C型呼吸機行機械通氣（江西省特力麻醉呼吸設備公司），呼吸頻率60次/min，潮氣量10 mL/kg，吸入100%氧氣。四肢連接心電圖導聯(lián)，接多功能監(jiān)測儀（美國太空公司）行心電監(jiān)測，置直腸溫探頭行深部體溫監(jiān)測。左股靜脈建立靜脈通道，微量泵泵注乳酸林格氏液2 mL/h。左股動脈置管監(jiān)測有創(chuàng)動脈壓。靜脈注射肝素300 IU/kg全身肝素化。采用特制帶網狀側孔16 G穿刺導管置入右頸內靜脈至右心房水平，引流靜脈血至貯血槽；右側頸動脈置24 G套管針，連接動脈灌注管。CPB環(huán)路主要由靜脈引流管、貯血槽、大鼠微型膜氧合器（廣東科威醫(yī)療器械有限公司）、BT00-300M型恒流蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）及動脈灌注管組成。采用無血預充，預充液總量約16 mL，由乳酸鈉林格氏液7 mL、琥珀酰明膠7 mL、20%甘露醇1 mL、5%碳酸氫鈉1 mL及肝素鈉150 IU/kg組成。CPB管理參照Cai等[1]介紹的方法。S組于穿刺后3 h，其余組于CPB結束后2 h取靜脈血3 mL，立即 4 ℃、3 000 r/min、離心5 min，分離血漿，-40℃保存；取大鼠左側腦組織，-70℃保存；取大鼠左側半球海馬區(qū)腦組織，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊若干，置入2.5%戊二醛保存。

1.3 檢測指標 （1）應用雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠血漿神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、S-100β蛋白水平（試劑盒購自美國Biokey公司，具體操作按說明書進行）。（2）應用放射免疫分析法測定大鼠血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）濃度（試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司）。（3）低溫下取腦組織，制備10%的腦組織勻漿，根據測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書對腦組織勻漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）進行測定。（4）將取出的大鼠左側海馬區(qū)腦組織小塊，置入1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋后切片，鈾、鉛雙染色，置于透射電鏡下觀察海馬區(qū)神經元細胞的超微結構。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平的變化 與S組比較，C組血漿NSE水平升高（P<0.01），C組和N組血漿S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平均升高（P<0.01）；與C組比較，N組血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01），見表1。

Table 1 Comparison of plasma levels of NSE,S-100β protein,TNF-α and IL-6 between groups表1 各組血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平的比較 （n=8，±s）

Table 1 Comparison of plasma levels of NSE,S-100β protein,TNF-α and IL-6 between groups表1 各組血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平的比較 （n=8，±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2同

組別S組C組N組F q S∶C S∶N C∶N NSE（μg/L）5.30±0.49 8.51±1.02 6.08±0.75 35.74**11.46**2.79 6.09**S-100β（ng/L）0.07±0.06 0.68±0.24 0.33±0.13 42.05**12.95**5.48**7.47**TNF-α（μg/L）0.93±0.17 2.45±0.52 1.73±0.67 17.84**8.46**4.42**4.01*IL-6（ng/L）57.98±9.17 176.06±30.70 98.67±27.49 71.67**16.67**5.74**10.92**

2.2 腦組織MDA和GSH-px含量的變化 與S組比較，C組、N組腦組織MDA含量升高、GSH-px含量降低（P<0.05或P<0.01）；與C組比較，N組腦組織MDA降低、GSH-px含量升高（P<0.01），見表2。

Table 2 Comparison of MDA and GSH-px contents in brain tissue between groups表2 各組腦組織MDA和GSH-px含量的比較 （±s）

Table 2 Comparison of MDA and GSH-px contents in brain tissue between groups表2 各組腦組織MDA和GSH-px含量的比較 （±s）

q1、q2分別為MDA和GSH-px組間兩兩比較結果

組別 n q1q2 S組C組N組F 8 8 8 MDA（μmol/g）14.06±3.51 68.75±25.63 34.51±16.47 346.71**GSH-px（U/mg）2.82±0.58 2.01±0.36 2.43±0.45 8.36**統(tǒng)計學處理組比S∶C S∶N C∶N 46.45**13.78**23.15**5.69**3.82*4.11**

2.3 超微結構的改變 S組海馬區(qū)神經元細胞形態(tài)正常，各細胞器未見異常；C組神經元細胞核變性、壞死，線粒體明顯腫脹、內有空泡形成；N組神經元內線粒體輕微水腫，電鏡結果見圖1～3。

3 討論

CPB心臟手術后約有30%的患者產生一定程度的器質性或功能性腦損傷，包括認知功能障礙，甚至致命性腦中風[2]。因此，有效地減少體外循環(huán)后的神經系統(tǒng)并發(fā)癥是臨床工作中急需解決的問題。目前，在圍CPB過程中應用藥物進行干預以減輕CPB后神經精神并發(fā)癥是CPB腦保護策略中重要的一部分。

NAC是廣泛應用的抗氧化劑，具有潛在的抗氧化和抗炎作用。NAC通過中和氧自由基、保護細胞膜、維持內皮細胞功能發(fā)揮保護作用[3]。研究表明，在損傷后靜脈應用NAC能顯著改善缺氧-復氧新生豬的頸動脈血流和氧供，減少腦皮質Caspase-3和脂質過氧化物含量的增加[4]。在CPB預充液中加入NAC，能夠減輕CPB對大鼠的腎損傷，且呈劑量依賴性[5]。而NAC對CPB所誘導的腦損傷是否具有保護作用，國內外罕見報道。心胸手術過程中應用CPB使機體與非生理表面接觸，CPB過程的非搏動血流、低灌注狀態(tài)等可激活氧化應激反應，而氧化應激反應可進一步激活炎性反應[6]。因此，選用具有抗氧化性質的試劑減輕氧化應激和氧化應激引起的炎性反應，以減少CPB后神經系統(tǒng)并發(fā)癥，為CPB后腦保護提供新思路和實驗依據。

NSE主要存在于中樞神經系統(tǒng)的神經元和神經內分泌細胞，S-100β蛋白濃度特異性地存在于中樞神經系統(tǒng)的神經膠質細胞、前部垂體細胞和郎罕細胞。NSE、S-100β蛋白分子質量大，正常情況下不能通過血腦屏障。當神經元、神經膠質細胞損傷或壞死后，NSE和S-100β蛋白迅速從細胞內溢入腦脊液，通過受損的血腦屏障進入血液中，致血漿NSE和S-100β蛋白濃度升高，其含量可反映神經元和神經膠質細胞損傷的程度，對早期直接而準確地了解腦損傷程度及評價患者的預后具有重要的臨床意義[7]。本研究表明，CPB使大鼠血漿NSE和S-100β蛋白濃度升高，提示CPB使神經元細胞和神經膠質細胞膜受損，NSE和S-100β蛋白釋放至細胞外間隙，通過受損的血腦屏障進入血液。NAC可減少大鼠血漿NSE和S-100β蛋白水平的升高，提示其可以減輕CPB所致的神經元細胞和神經膠質細胞損傷。

TNF-α與IL-6是CPB過程產生的促炎因子。TNF-α是引起炎性級聯(lián)反應的一個重要而又具有廣泛生物學活性的細胞因子，它也是炎性反應釋放最早和最重要的內源性介質。TNF-α可激活中性粒細胞釋放彈性蛋白酶和氧自由基等，參與中性粒細胞介導的內皮損傷，如果釋放到細胞外，可引起自身組織的破壞。有研究表明，TNF-α在CPB過程中持續(xù)升高，在CPB結束后2 h達高峰[8]。IL-6是腦損傷炎癥反應鏈中的一種重要炎性細胞因子，主要通過誘導最初的炎性級聯(lián)反應、誘導血管內皮黏附因子表達、增強興奮性氨基酸毒性作用、降低腦血流、增加血腦屏障通透性等機制在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮作用[9]。基于上述原因，以TNF-α和IL-6作為反映CPB中炎性反應的指標。本研究表明，CPB使大鼠腦組織脂質過氧化反應的代謝產物MDA含量升高、氧自由基清除劑GSH-px含量降低，使血漿TNF-α和IL-6水平均升高，提示CPB可誘發(fā)氧化應激和炎性反應。NAC可減少CPB誘導的大鼠腦組織MDA含量的升高及GSH-px含量的降低，可降低血漿TNF-α、IL-6水平的升高，提示NAC可降低CPB所誘發(fā)的氧化應激和炎性反應程度。

海馬區(qū)是大腦對缺血缺氧最敏感的部位之一，本研究的電鏡結果顯示，CPB可致大鼠海馬區(qū)神經元細胞線粒體水腫、核變性，而在CPB期間應用NAC可以減輕其病理性損傷。

Figure 1 Computed tomography imaging of tumour in right lobe of liver approach medium-sized vein圖1 CT影像提示肝右葉腫瘤臨近肝中靜脈

Figure 2 Three-dimensional computer reconstruction of the relationship between tumour and medium-sized vein of liver圖2 計算機三維重建顯示腫瘤與肝中靜脈的關系

Figure 3 Three-dimensional computer reconstruction of the congestion area(blue color)at the left of internal lobe after resection of medium-sized vein圖3 計算機重建切除肝中靜脈后左內葉的淤血區(qū)域（藍色）

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