重癥甲型H1N1流感病毒肺炎患者多臟器病理研究

茹永新 楊敬平 李月川 賈 瑋 趙 勇 李 睿 徐喜媛 趙軾軒 龐天翔

甲型H1N1流感是變異的甲型H1N1流感病毒引起的以呼吸道癥狀為主要表現(xiàn)的傳染性疾病。該病2009年3月起源于墨西哥和美國西南部，2009年5月開始在國內(nèi)蔓延，據(jù)我國衛(wèi)生部通報，截至2009年12月31日境內(nèi)感染近12萬例，死亡648例[1]。盡管普遍認為流感病毒引發(fā)的急性肺損傷或呼吸窘迫綜合征和原有心、肺及代謝性疾病的加重是患者病情加重或死亡的主要原因，但多臟器病理活檢在揭示疾病本質(zhì)和死因方面仍有不可替代的作用。本研究在分析12例重癥甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，對其中5例死亡患者進行多個臟器的病理學(xué)研究，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組12例患者均于2009年11月—12月發(fā)病，9例在內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院呼吸重癥監(jiān)護病房（RICU）住院治療，3例在天津市胸科醫(yī)院RICU住院治療。結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)、心電圖、痰菌培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測結(jié)果，依據(jù)衛(wèi)生部《甲型H1N1流感診療方案（2009年第3版）》，所有患者確診為重癥甲型H1N1流感病毒性肺炎。本組患者均為男性，年齡30～79歲，平均（57.0±16.7）歲，所有患者以發(fā)熱、咳嗽發(fā)病，其中氣短10例，肌痛9例，咯血2例；胸部影像學(xué)提示肺炎、間質(zhì)肺炎12例（其中伴纖維化4例）。心電圖示竇性心動過速5例、完全性右束支傳導(dǎo)阻滯2例、心肌缺血表現(xiàn)2例、房顫1例、室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯1例、竇性心律1例。痰細菌培養(yǎng)鮑曼不動桿菌、白假絲酵母、鏈球菌、金黃色葡萄球菌各1例，陰性8例。經(jīng)住院治療，7例痊愈出院，5例死亡。

1.2 病理研究方法 5例死亡患者臨床死亡后5 min內(nèi)纖維支氣管鏡下取支氣管黏膜組織，經(jīng)皮穿刺取肺、肝、心和腓腸肌組織。標本用3%戊二醛固定，部分標本行蘇木素-伊紅和吉姆薩染色，部分按照透射電鏡標本制備。電鏡標本塊用瑞典LKB超薄切片機切成50 nm厚度切片，醋酸鈾和硝酸鉛染色，日本東芝H600電鏡觀察[2]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，計量資料采用±s或M（P25，P75）表示。

2 結(jié)果

2.1 實驗室檢查結(jié)果 2例白細胞（WBC）升高，其余10例在正常范圍。11例動脈氧分壓[p（O2）]降低，8例動脈二氧化碳分壓[p（CO2）]降低。11例乳酸脫氫酶（LDH）和α-羥丁酸脫氫酶（HBDH）升高，6例肌酸激酶（CK）升高，8例天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）升高，10例C反應(yīng)蛋白（CRP）升高，見表1。

Table 1 Laboratory results of patients表1 患者實驗室檢查結(jié)果

2.1 光鏡及電鏡下表現(xiàn) 見圖1～4。

2.2.1 支氣管黏膜和肺 光鏡下支氣管黏膜廣泛壞死，上皮細胞脫落溶解，其間摻雜成熟粒細胞和單核巨噬細胞（圖1A），黏膜完整區(qū)域黏膜下層纖維組織結(jié)構(gòu)正常，炎性細胞少，局部扁平上皮細胞化生。電鏡下壞死組織中和上皮細胞內(nèi)偶見病毒顆粒（圖4A），壞死組織中有板層小體，1例患者上皮細胞同時含球菌和病毒顆粒。

肺組織廣泛實變，Ⅱ型肺上皮細胞、成纖維細胞和細胞外基質(zhì)為主要成分（圖1B），Ⅰ型上皮細胞少，殘留肺泡腔內(nèi)大量脫落、壞死上皮細胞和少量中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。Ⅱ型肺泡上皮細胞高度增生，充滿肺泡，空泡化明顯，肺泡和上皮細胞內(nèi)有大量板層小體（圖1C、1D、3A）。肺毛細血管數(shù)量少，部分壞死，周圍有大量滲出，血管腔內(nèi)有病毒顆粒。部分肺組織纖維化，成纖維細胞增多，周圍有大量束狀膠原（圖3B）。電鏡下Ⅱ型肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞均含病毒顆粒，細胞結(jié)構(gòu)損傷嚴重。

2.2.2 心肌和腓腸肌 心肌和腓腸肌部分組織損傷，肌細胞含脂滴，肌節(jié)紊亂，肌纖維排列紊亂、斷裂、溶解，自噬體形成；部分區(qū)域灶性壞死，肌細胞溶解壞死，結(jié)構(gòu)消失（圖2A、B）；部分區(qū)域肌組織纖維化，成纖維細胞增多，周圍有大量膠原。血管內(nèi)皮細胞破壞和溶解，周圍滲出明顯；浦肯野纖維或細胞損傷（圖3C）。病毒顆粒分布于心肌和腓腸肌細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞，壞死區(qū)域密度最高；組織結(jié)構(gòu)相對正常區(qū)域和結(jié)構(gòu)完整細胞內(nèi)病毒顆粒少（圖4B、C）。

2.2.3 肝組織 肝細胞廣泛脂肪化或空泡形成，部分細胞出現(xiàn)不同程度核損傷或呈凋亡形態(tài)，核仁顯著，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)肝細胞壞死，壞死和損傷部位炎性細胞少；血管周圍和肝竇內(nèi)滲出明顯，竇內(nèi)皮和血管內(nèi)皮細胞損傷明顯（圖2C、2D、3D）。病毒主要分布于壞死和損傷區(qū)域肝細胞、血管內(nèi)皮細胞和肝竇上皮細胞，以及巨噬細胞內(nèi)，損傷較輕和結(jié)構(gòu)完整細胞中病毒少，血管和竇腔偶見病毒（圖4D）。

2.2.4 病毒顆粒結(jié)構(gòu) 受累及組織細胞中H1N1病毒呈多形性，少數(shù)病毒結(jié)構(gòu)完整，直徑120 nm左右，由表到里依次為齒輪樣低密度蛋白殼、單層膜、空白間隙和高密度核酸蛋白芯；大部分病毒顆粒缺乏齒輪樣低密度蛋白殼，直徑100 nm左右，由單層膜、核酸蛋白芯和兩者間隙組成，間隙局部增寬時，顆粒外觀呈橢圓形；偶見絲狀或長條形結(jié)構(gòu)，橫斷直徑與病毒核酸顆粒大小一致，周圍有病毒顆粒。

3 討論

本組12例患者有發(fā)熱、咳嗽和氣短，胸部影像顯示肺炎、肺間質(zhì)炎，4例有肺纖維化表現(xiàn)；血細胞分析除2例白細胞總數(shù)升高外，10例患者在正常范圍，咽拭子檢測甲型H1N1流感病毒陽性，符合甲型H1N1流感病毒上呼吸道感染特點；血氣分析，11例p（O2）降低，8例p（CO2）降低，說明大部分患者呼吸功能嚴重障礙。綜合臨床表現(xiàn)、肺部影像學(xué)及其他實驗室檢查結(jié)果，本組患者病情明顯重于國內(nèi)報道平均水平[3]，符合重癥甲型H1N1流感病毒肺炎診斷要點[4]。5例死亡患者中4例合并肺部細菌感染，其中1例電鏡發(fā)現(xiàn)脫落和死亡的黏膜及肺泡上皮細胞中同時存在病毒和細菌，符合細菌感染與甲流患者病情加重和死亡相關(guān)的報道[5]。

美國有學(xué)者研究34例25～49歲甲型H1N1流感死亡患者肺病理，主要表現(xiàn)包括氣管炎、支氣管炎和彌漫性肺泡損傷，免疫組化和RT-PCR顯示氣管、支氣管、肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞甲型H1N1流感病毒陽性，部分患者合并細菌性肺炎[6]。這些特點與本組5例死亡患者支氣管和肺部分病理改變相同，說明流感病毒可引起不同年齡患者相同的呼吸系統(tǒng)病理損傷。此外，本組5例死亡患者支氣管鱗狀上皮局部化生，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生，充滿肺泡，成纖維細胞增生并合成大量膠原，使肺組織嚴重實變和纖維化，與日本報道的肺病理基本一致[7-9]，說明肺實變和纖維化是重型甲型H1N1流感病毒性肺損傷的重要病理特征，是患者呼吸功能衰竭的重要原因。

流感患者死因一般包括3個方面：（1）強大的病毒毒力，如1918年世界性大流感中多數(shù)患者數(shù)天內(nèi)死亡，2005年南亞H5N1禽流感中患者主要死于病毒性肺炎引起的急性呼吸窘迫綜合征[10]。（2）病毒感染誘發(fā)的繼發(fā)性細菌感染。（3）病毒感染導(dǎo)致的心、肺慢性疾病或糖尿病等基礎(chǔ)疾病加重。通常流感病毒沒有足夠毒力通過單獨侵犯肺部導(dǎo)致患者死亡，因此現(xiàn)在認為1918年的大部分年輕流感患者死于繼發(fā)性細菌感染[5]。同樣，目前認為甲型H1N1流感病毒肺炎繼發(fā)細菌性肺炎和基礎(chǔ)疾病加重是患者病情加重和死亡的主要因素。

自2009年甲型H1N1流感在全世界爆發(fā)以來，多數(shù)患者有不同程度肌痛，部分患者有心肌缺血、心律失常和心功能受損表現(xiàn)；病情較重患者血清LDH、α-HBDH、CK和AST升高[11]，這些病理特點已經(jīng)作為臨床診斷和重癥患者分類的重要指標。這些病理變化普遍被認為是病毒性肺炎誘發(fā)的多臟器損傷或原有基礎(chǔ)疾病加重所致[5]，尚少見病毒侵犯肺組織同時直接侵犯其他臟器以及此方面的病毒和病理研究報道。

本組12例患者發(fā)病后11例出現(xiàn)不同程度心律失常和心肌缺血，7例肌痛明顯，11例LDH和HBDH升高，6例CK升高，8例AST增高，提示心肌、其他系統(tǒng)肌肉或肝臟受累。光鏡和電鏡研究5例死亡患者心肌、肝臟和骨骼肌，發(fā)現(xiàn)各臟器除出現(xiàn)不同程度局灶性溶解和壞死外，損傷和壞死部位含大量病毒顆粒，炎性細胞浸潤少，損傷較輕或結(jié)構(gòu)正常部位病毒顆粒少，證實器官損傷與病毒直接侵入破壞有關(guān)，與繼發(fā)性損傷，尤其是單核/巨噬系統(tǒng)或淋巴細胞浸潤關(guān)系不大。CRP升高常見于細菌感染、組織損傷或壞死，以及心肌梗死和心功能不全，單純病毒感染多為陰性或弱陽性，所以通常用于鑒別細菌與病毒感染。本組12例患者中10例顯著升高，一方面可能與多臟器損傷有關(guān)，另一方面與合并細菌感染相關(guān)。

綜上，筆者認為甲型H1N1流感病毒不僅能直接感染肺組織，引起病毒性肺炎和嚴重肺損傷，而且可以侵犯多個器官，引起多臟器損傷和功能衰竭，導(dǎo)致患者病情加重和死亡。

Figure 1 Photos of bronchus and lung tissues圖1 支氣管和肺組織

Figure 2 Photos of myocardium,gastrocnemius and liver(HE staining)圖2 心肌、腓腸肌和肝組織（HE染色）

Figure 3 Photos of ultrastructural pathology圖3 超微病理

Figure 4 Photos of virus particles圖4 病毒顆粒

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