HPLC法測定人血漿中阿托伐他汀的濃度及其藥動學(xué)研究

朱春健

（江蘇泰州市中醫(yī)院藥劑科，江蘇泰州 225300）

HPLC法測定人血漿中阿托伐他汀的濃度及其藥動學(xué)研究

朱春?。?/p>

（江蘇泰州市中醫(yī)院藥劑科，江蘇泰州 225300）

目的：建立測定人血漿中阿托伐他汀片濃度的方法并考察其藥動學(xué)。方法：選擇20名男性健康志愿受試者，口服阿托伐他汀片10 mg，采用高效液相色譜法測定血藥濃度，計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：阿托伐他汀血藥濃度在0.1～12.5μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，日內(nèi)、日間RSD均＜9%，方法回收率為89.00%～103.00%；阿托伐他汀的主要藥動學(xué)參數(shù)為：t1/2（14.40±7.10）h，tmax（1.50±0.70）h，cmax（6.10±3.40）μg·L－1，AUC0～48h（50.60±43.60）μg·h·L－1，AUC0～∞（56.70±42.50）μg·h·L－1，MRT0～48h（3.68±0.75）h，MRT0～∞（3.82±0.71）h。結(jié)論：本方法適用于阿托伐他汀人體藥動學(xué)的研究。

阿托伐他??；高效液相色譜；藥動學(xué)

阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑[1]，可抑制體內(nèi)膽固醇的合成，降低血清低密度脂蛋白（LDL）含量，干擾脂蛋白生成，降低血清甘油三酯水平[2]。臨床上主要用于原發(fā)性高膽固醇血癥、混合型高脂血癥和高膽固醇血癥并有動脈粥樣硬化患者，但服藥后易產(chǎn)生便秘、腹脹、消化不良和腹痛等不良反應(yīng)，且大劑量服用后可能干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激能力、導(dǎo)致橫紋肌溶解、損傷肝腎功能及肌酸激酶等毒副作用[3，4]。因此，加強阿托伐他汀血藥濃度監(jiān)測具有重要臨床意義。以往研究發(fā)現(xiàn)[5]，液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）法測定易受所需設(shè)備限制，而采用乙腈-甲醇-水三元流動相發(fā)現(xiàn)ODS柱拖尾嚴(yán)重。動物研究發(fā)現(xiàn)[6]，反向高效液相色譜（RP-HPLC）法適用于阿托伐他汀片動物藥動學(xué)的研究。筆者采用高效液相色譜（HPLC）法檢測人體內(nèi)阿托伐他汀的含量，從而進行藥動學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、全自動進樣器、紫外可見分光光度檢測器、柱溫箱、二維液相操作軟件（美國Agilent公司）；TGL-18C-C高速臺式離心機（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）；YKH-3/YKH-A快速液體混合器（北京鴻順達(dá)科技有限公司）；Sartorius BS110S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥

阿托伐他汀片（美國輝瑞（Pfizer）制藥有限公司，藥品生產(chǎn)批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20051409）；阿托伐他汀對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100590-200901，含量：99.2%）；內(nèi)標(biāo)：格列齊特對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100269-200402）；甲醇與乙腈為色譜純，乙酸乙酯、冰醋酸及醋酸銨等均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18柱（250 mm×4.6 mm 5μm）；流動相：乙腈-0.02 mol·L－1醋酸緩沖液（65：35）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長：阿托伐他汀249 nm，格列齊特228 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL；理論板數(shù)＞3 000；采用雙波長掃描法測定。高效液相色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿+阿托伐他汀對照品+內(nèi)標(biāo)（249 nm）；B.空白血漿+阿托伐他汀對照品+內(nèi)標(biāo)（228 nm）；C.受試者血漿+內(nèi)標(biāo)（249 nm）；D.受試者血漿+內(nèi)標(biāo)（228 nm）；1.阿托伐他??；2.格列齊特Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma+atorvastatin control+internal standard（249 nm）；B.blank plasma+atorvastatin control+internal standard（228 nm）；C.plasma sample of volunteer+internal standard（249 nm）；D.plasma sample of volunteer+internal standard（228 nm）；1.atorvastatin；2.gliclazide

2.2 受試者選擇

20名男性健康志愿者，年齡（23.1±1.3）歲，體重（68.5±6.0）kg，身高（172.4±7.7）cm，無煙酒嗜好，無精神病史以及其他慢性病史，經(jīng)體檢證明其心、肝、腎功能正常，無藥物致變態(tài)反應(yīng)史和藥物依賴史。受試前2周至試驗期間不服用其他任何藥物，試驗期間禁煙、酒及含咖啡因的飲料，統(tǒng)一清淡飲食。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，而且所有受試者均簽署知情同意書，自愿參加阿托伐他汀片體內(nèi)藥動學(xué)試驗。

2.3 溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取阿托伐他汀對照品適量，準(zhǔn)確稱定，加水制成0.5 mg·mL－1的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液。（2）內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取格列齊特對照品0.2 g，加入適量的去離子水，制成50μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 血樣處理

移取血漿1 mL于5.0 mL離心試管中。加入內(nèi)標(biāo)（50μg·mL－1格列齊特）溶液0.1 mL和35%高氯酸0.2 mL，渦旋振蕩30 s，12 000 r·min－1離心（離心半徑10 cm）10 min ，取上清液約0.5 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)血漿，進樣測定。

2.5 線性關(guān)系考察

配制濃度為2、5、10、50、100、250μg·mL－1的阿托伐他汀溶液，各取20μL于無菌EP管中，分別加入空白血漿400μL，充分混勻，制成濃度為0.1、0.25、0.5、2.5、5、12.5μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)血藥溶液。按“2.4”項下方法處理后，進樣10μL，記錄色譜圖，以濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝0.317c+1.291（r＝0.999，n＝6）。結(jié)果表明，阿托伐他汀血藥濃度在0.1～12.5μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。并在上述色譜條件下，將供試樣品溶液稀釋后進樣至信噪比（S/N）＝3時，得阿托伐他汀的檢測限為0.1 ng·mL－1。

2.6 精密度與回收率試驗

取阿托伐他汀對照品，制成由低到高5個濃度不同的供試樣品，日內(nèi)測定5次，日間測定5次，按“2.4”項下方法操作并測定，計算回收率和日內(nèi)、日間RSD，精密度及回收率試驗結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.4”項下溶液，分別在 0、2、4、6、8、10、12 h時進樣測定，記錄峰面積，考察供試樣品溶液放置穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)測定的主峰面積無顯著性變化，RSD＝0.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.8 藥動學(xué)試驗

試驗前禁食12 h，服用受試制劑10 mg，分別于服藥前和服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、18.0、30.0、48 h時抽取肘靜脈血5.0 mL于抗凝離心管中，4 000 r·min－1離心（離心半徑10 cm）3 min，分離血漿測試。服藥2 h內(nèi)不飲水，4 h后進食統(tǒng)一低脂肪午餐。受試者服藥后避免劇烈運動和長時間臥床，30 h內(nèi)不能離開臨床觀察室。試驗期間，受試者均未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。服用阿托伐他汀片后的平均藥-時曲線見如圖2，受試者口服阿托伐他汀片后平均藥動學(xué)參數(shù)見表2。

圖2 受試者口服阿托伐他汀片后平均藥-時曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of atorvastatin in volunteer after oral administration of Atorvastatin tablets

表2 受試者口服阿托伐他汀片后平均藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 Mean pharmacokinetic parameters of atorvastatin in volunteer after oral administration of Atorvastatin tablets

3 討論

采用乙腈-20 mmol·L－1磷酸二氫鉀為流動相，結(jié)果分離度不好；選用甲醇-0.5%甲酸（80∶20）為流動相，內(nèi)源性物質(zhì)有干擾；將流動相更換為乙腈-0.02 mol·L－1醋酸緩沖液（65∶35），內(nèi)標(biāo)和阿托伐他汀得到良好分離，峰形良好，不受內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。在本試驗條件下比較辛伐他汀、氟伐他汀作為內(nèi)標(biāo)的可行性，兩者提取率較低、出峰太晚，而格列齊特提取回收率比較高，最后選擇格列齊特作為本試驗內(nèi)標(biāo)。

采用LC-MS/MS法測定阿托伐他汀濃度，劉巍等[7]測定0.1μg·L－1阿托伐他汀日間和日內(nèi)RSD分別為10.01%和14.05%；姜楠等[8]測定0.25μg·L－1阿托伐他汀為（0.248±0.053）μg·L－1，日間和日內(nèi)RSD分別為7.30%和11.10%；常瑛等[9]測定阿托伐他汀cmax為（3.1±0.5）μg·L－1、tmax為（6.2±0.6）h、MRT0～∞為（65.3±8.5）h、AUC0～∞為（154±30）μg·h·L－1，與本研究測定結(jié)果差別較大，可能與測定方法不同和個體差異有關(guān)。

綜上所述，本法選用實驗室常用的HPLC儀，血漿量少，處理方法簡單，內(nèi)標(biāo)分離效果好，建立了HPLC法測定血漿中阿托伐他汀藥物濃度的方法，具有快速、靈敏、重復(fù)性好的特點，可滿足阿托伐他汀藥動學(xué)研究要求。

[1] Shin J，Pauly DF，Pacanowski MA，et al.Effect of cytochrome P4503A5 genotype on atorvastatin pharmacokinetics and its interaction with clarithromycin[J].Pharmacotherapy，2011，31（10）：942.

[2]Furman A，Meier JL，Malmstrom RA，et al.Comparative efficacy of ezetimibe/simvastatin，rosuvastatin，and atorvastatin in uncontrolled hyperlipidemia patients[J].Am JManag Care，2011，17（8）：538.

[3]Yu XL，Zhang HJ，Ren SD，et al.Effects of loading dose of atorvastatin before percutaneous coronary intervention on periprocedural myocardial injury[J].Coron Artery Dis，2011，22（1）：87.

[4]Robinson JG，Ballantyne CM，Grundy SM，et al.Lipid-altering efficacy and safety of ezetimibe/simvastatin versus atorvastatin in patients with hypercholesterolemia and the metabolic syndrome（from the VYMET study）[J].Am J Cardiol，2009，103（12）：1 694.

[5] 沈海蓉，李中東，鐘明康.RP-HPLC法測定Beagle犬血漿中阿托伐他汀的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（6）：718.

[6] 竇宇紅，吳雄君，蔣 艷.RP-HPLC法測定阿托伐他汀在新西蘭兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2010，10（8）：1 443.

[7] 劉 巍，張 慶.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿苯磺酸氨氯地平與阿托伐他汀鈣濃度[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，29（6）：698.

[8] 姜 楠，楊永革，許雪廷，等.LC-MS-MS法測定人血漿中阿托伐他汀濃度[J].藥學(xué)實踐雜志，2011，29（1）：15.

[9] 常 瑛，文愛東，李昌煒，等.復(fù)方苯磺酸氨氯地平/阿托伐他汀鈣片的人體藥動學(xué)[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（19）：1 672.

Determination of Atorvastatin in Human Plasma by HPLC and Pharmacokinetics Study

ZHU Chun-jian
（Dept.of Pharmacy，Taizhou Hospital of TCM of Jiangsu Province，Jiangsu Taizhou 225300，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the determination of atorvastatin in human plasma and study its pharmacokinetics.METHODS：20 male healthy volunteers were given Atorvastatin tablets 10 mg orally.The plasma concentration of atorvastatin was determined by HPLC，and pharmacokinetic parameters were measured.RESULTS：The linear range of atorvastatin were 0.1～12.5μg·mL－1，theintra-day and inter-day RSD were all＜9%，the recovery test result were 89.00%～103.00%.The main pharmacokinetic parameters of atorvastatin were as follow：t1/2（14.40±7.10）h，tmax（1.50±0.70）h，cmax（6.10±3.40）μg·L－1，AUC0～48h（50.60±43.60）μg·h·L－1，AUC0～∞（56.70±42.50）μg·h·L－1，MRT0～48h（3.68±0.75）h，MRT0～∞（3.82±0.71）h.CONCLUSION：The method is suitable for pharmacokinetic study of atorvastatin in healthy volunteer.

Atorvastatin；HPLC；Pharmacokinetic

R969.1；R972+.6

A

1001-0408（2012）30-2833-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.30.20

2011-10-07

2011-12-06）