細胞培養(yǎng)法測定接觸混苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞微核試驗

王艷紅，李昊宇，韓立君，張勇凱，龐旭光

(吉林鐵路疾病預防控制所，吉林 吉林 132001)

苯、甲苯、二甲苯統(tǒng)稱為混苯，是一種工業(yè)用途廣泛的職業(yè)有害因素，苯是人類致癌物和致突變物，具有致腫瘤和生殖毒性作用，甲苯、二甲苯的致突變性目前尚不確定，但越來越多證據(jù)表明兩者均有可能是致突變劑。倪祖堯等［1－2］的研究表明混苯作業(yè)工人外周血DNA損傷明顯增加。為了解接觸混苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞微核率，我們于2012年5月對吉林某地35名接觸混苯作業(yè)工人用細胞培養(yǎng)法檢測外周血淋巴細胞微核，結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象

吉林某地接觸混苯作業(yè)工人35名為實驗組，20名工人為對照組，除不接觸混苯外其他條件與實驗組相近。

1.2 試劑

RPMI1640 培養(yǎng)基(5 mL):PHA(30 μg/mL)+雙抗 +胎牛血清(10%)+谷氨酰胺(0.002 mol/L)pH(7.0±0.2)，購于北京協(xié)和基礎(chǔ)所;固定液:甲醇∶冰醋酸 =4∶1(體積比)，用前配，并放4℃保存2 h以上;低滲液:即配制0.075 M氯化鉀溶液，取3 g氯化鉀溶于536 mL雙蒸水即可，用前4℃存放2 h以上;Giemsa染液:Giemsa:磷酸鹽緩沖液(pH6.8)=1∶9(體積比)，用前配。

1.3 方法

1.3.1 約0.4 mL的肝素抗凝血，加5 mL培養(yǎng)瓶中，混勻以防止血凝塊形成，37℃培養(yǎng)72 h。

1.3.2 小心吸棄大部分上清液(余下不超過4 mL)，輕柔吹勻，轉(zhuǎn)移入10 mL離心管中。150 g離心7 min，吸棄上清液。

1.3.3 加入2 mL 0.075 M氯化鈉(4℃)，輕柔吹散(6下)，立即加入固定液1.5 mL(4℃)，混勻(5下)，150 g離心10 min，吸棄上清液。

1.3.4 沿管壁緩緩加入3 mL固定液，混勻，立即150 g離心10 min，吸棄上清液。

1.3.5 再次加入3 mL固定液，混勻，150 g離心10 min，吸棄上清液。如液體不呈透明色，需重復1次。

1.3.6 剩余500 μL固定液，吹散混勻。

1.3.7 滴片:將玻片從冰水中取出，滴片(10 cm高度)，自發(fā)干燥。

1.3.8 染色:10%Giemsa染液染色15 min。

1.3.9 讀片:1 000倍光鏡下，計數(shù)1 000個淋巴細胞微核率，以千分率報告。

2 結(jié)果

2.1 一般情況，接觸組工人平均年齡(39.6±3.6)歲，平均接觸混苯工齡(15.9±3.3)a;對照組平均年齡39.1歲，平均工齡(15.4±2.9)a。

2.2 接觸混苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞微核率明顯高于對照組，其中最高可達23‰，最低6‰，其結(jié)果見表1。測定現(xiàn)場混苯濃度均不超過國家衛(wèi)生標準(苯 2 mg/m3，甲苯 20 mg/m3，二甲苯40 mg/m3)，但隨著接觸混苯作業(yè)的工齡增加，其外周血淋巴細胞微核率增高。其結(jié)果見表2。

表1 接觸混苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞微核率檢測結(jié)果 (±s)

表1 接觸混苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞微核率檢測結(jié)果 (±s)

* 與對照組比較P＜0.01

組別 檢查人數(shù) 觀察細胞數(shù) 微核范圍 微核總數(shù) 微核率/‰接觸組35 35 000 6～23 467 11.12±1.12對照組20 20 000 1～6 60 3.02 ±0.37

表2 工齡對接觸混苯微核率的影響 (±s)

表2 工齡對接觸混苯微核率的影響 (±s)

*與對照組比較P＜0.01

工齡(t/a) 人數(shù) 觀察細胞數(shù) 微核范圍 微核總數(shù) 微核率/‰5～10 15 15 000 6～14 191 10.14±2.42 11～15 20 20 000 8～23 276 12.25±1.98

3 討論

淋巴細胞微核是在細胞分裂過程中，染色體斷片或染色體行動滯后，未能進入細胞參與細胞核的形成，游離于細胞質(zhì)中形成的小核，游離于淋巴細胞中的小核稱淋巴細胞微核。國內(nèi)試驗表明混苯是一種較強的染色體斷裂劑［2－3］，此次試驗結(jié)果表明接觸混苯作業(yè)工人外周血淋巴細胞微核率明顯高于對照組，現(xiàn)場測定混苯濃度沒有超過國家標準，隨著接觸混苯的工齡增加其外周血淋巴細胞微核率也增高，說明接觸混苯對人體具有一定遺傳損傷效應。

外周血淋巴細胞微核的測定方法目前有三種:一種是直接法，此方法不好識別，易造成假陽性，目前已經(jīng)淘汰;另一種是胞質(zhì)分裂阻斷微核法，此方法需要的細胞松胞素-β目前價格較昂貴，基層單位不宜普及。我們采用的是細胞培養(yǎng)法，也就是淋巴細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)，完成一次細胞分裂后，制備標本，觀察游離于轉(zhuǎn)化的淋巴細胞胞質(zhì)中的微核方法。用此方法在油鏡下觀察細胞體積明顯增大，細胞漿明顯增多，細胞核于微核之間游離度有所增大，細胞染色十分理想，經(jīng)試驗獲得滿意效果。

根據(jù)本次試驗觀察，大多數(shù)受檢淋巴細胞中含有嗜天青顆粒，應注意與微核在形態(tài)上的區(qū)別。微核著色淺，可見到核結(jié)構(gòu)，遮光性較弱;嗜天青顆粒著色較深，無核結(jié)構(gòu)，遮光性強。淋巴細胞微核的判斷標準是:在完整的淋巴細胞內(nèi)，游離于胞漿中，與主核完全分開，若有重疊或相切必須看到各自完整的核膜，圓形或橢圓形，大小在主核的三分之一以下，結(jié)構(gòu)與主核一致，染色與主核相同或略淺。該方法簡便，無需特殊器材，易于應用和掌握，結(jié)構(gòu)重復性好，適合于基層單位使用。

［1］倪祖堯，逢兵，孟建峰，等．單細胞電泳檢測接觸苯、甲苯、二甲苯工人外周血細胞DNA損傷［J］．衛(wèi)生毒理學雜志，1996，10(4):267 －268．

［2］朱志良，莊志雄，黃鈺，等．混苯作業(yè)外周血細胞DNA損傷的檢測［J］．現(xiàn)代預防醫(yī)學，2002，29(4):498 －500．

［3］薛明，吳小榮．苯代謝物1，2，42苯三醇對 K562細胞的凋亡誘導和分化抑制作用［J］．毒理學雜志，2009，23(6):425－428．

［4］張美榮，趙華碩，周建華．苯致小鼠淋巴細胞 DNA、RNA損傷作用［J］．中國公共衛(wèi)生，2006，22(8):975 －977．