靜電紡納米纖維基組織工程大孔支架的研究進(jìn)展

趙仕芳 袁卉華 張彥中

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

引言

組織工程的目的是開發(fā)生物替代品來修復(fù)受損的組織或器官［1］。在組織工程中，支架是決定組織工程成敗的關(guān)鍵因素之一，起到細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的作用，因而在原理上應(yīng)對細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能實(shí)現(xiàn)仿生［2］。天然的ECM主要由蛋白纖維(如10到幾百納米的纖維狀的膠原蛋白和彈性蛋白)交織在一起，構(gòu)成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由于ECM超細(xì)纖維狀的多孔形貌對于細(xì)胞的基本生理活動有重大的影響，所以用納米纖維狀的仿生材料取代傳統(tǒng)的多孔支架將是合理的對ECM結(jié)構(gòu)和形態(tài)的仿生［3］。在過去10年中，納米科技的飛速發(fā)展已使越來越多的研究者把仿生納米纖維應(yīng)用于組織工程。在制備納米纖維的各種方法(如自組裝、相分離、靜電紡絲等)中，靜電紡絲方法具有簡便快捷、成本低廉、結(jié)構(gòu)可控等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最有可能實(shí)現(xiàn)連續(xù)納米纖維工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù)，有望成為理想的組織工程仿生支架的制備方法［4］。

靜電紡絲制備的纖維直徑通常在亞微米級(俗稱納米纖維)，在尺寸和形貌上對ECM有較好的仿生，是當(dāng)今組織工程支架材料研究的熱門［5－6］。近年來，靜電紡支架已被廣泛應(yīng)用在軟骨、骨、皮膚、角膜、神經(jīng)、肌腱和韌帶等組織工程研究領(lǐng)域［7－8］。但是，由于靜電紡支架的纖維排列緊密、纖維之間的空隙過小，使細(xì)胞難以長入，無法構(gòu)建出較厚的組織［3］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，只有小的納米粒子(＜300 nm)可以穿過靜電紡無紡布的膜，而大的粒子(＞1 μm)則被截留［9］。具體到組織工程應(yīng)用，多數(shù)的動物細(xì)胞的大小一般為10～100 μm，而靜電紡纖維直徑通常在500 nm左右的無紡布的孔徑是小于10 μm的，二者尺寸上的不相稱顯然不利于細(xì)胞的向內(nèi)生長，盡管也有研究表明納米纖維支架能一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的長入［10－12］。為了解決這一問題，近年來有各種各樣的方法被用來擴(kuò)大靜電紡納米纖維支架的孔尺寸。筆者首先討論了組織工程支架中微孔的重要性及對細(xì)胞的影響，然后對最近發(fā)展的各種擴(kuò)大孔尺寸的方法進(jìn)行了總結(jié)、歸類和分析，并指出這些方法的不足及今后的發(fā)展方向。

1 組織工程支架中大孔對細(xì)胞的影響

在組織構(gòu)建(再生)過程中，尤其對于皮膚、骨骼、肌肉的組織工程構(gòu)建，細(xì)胞長入支架的程度是很重要的因素［13］。組織工程支架的孔尺寸、孔隙率和相連的孔形態(tài)對細(xì)胞的行為有很大的影響，尤其決定了細(xì)胞和組織長入支架的程度。這一結(jié)論已在聚已酸內(nèi)酯(PCL)［14］、聚氨基甲酸乙酯、聚(乳酸－乙醇酸)(PLGA)［16－17］、聚乳酸(PLA)［18］、明膠［19］等聚合物上，通過培養(yǎng)成纖維細(xì)胞［14］、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞［20］、軟骨細(xì)胞［21］、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞［22］得到證實(shí)。此外，支架的微孔對細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、形態(tài)、分化、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌等方面都有影響。

對于不同的細(xì)胞，支架的最適孔徑尚無定論，但幾十到幾百微米的孔徑對于細(xì)胞的遷移和長入支架內(nèi)部通常認(rèn)為是必需的［23］。合適的孔尺寸、高的孔隙率(＞90%)和相連的孔形態(tài)，對于大量細(xì)胞的種植、細(xì)胞和組織的生長、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、氧氣和營養(yǎng)的傳輸、代謝物的排泄以及血管和神經(jīng)的內(nèi)生長起著決定作用［24］。

2 擴(kuò)大靜電紡纖維支架孔徑的方法

近年來，不同的研究者利用各種方法來擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑，大致包括瀝濾法、光刻蝕法、微－納米纖維復(fù)合法、改變接收裝置法、和超聲法等(見表1)。這些方法制備出的支架，其培養(yǎng)細(xì)胞的結(jié)果和在組織工程中的應(yīng)用分述如下。

表1 擴(kuò)大靜電紡支架孔尺寸的方法匯總Tab.1 Techniques used to increase the pore size of electrospun scaffolds

2.1 瀝濾法

瀝濾法或其結(jié)合氣體發(fā)泡等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架的制備。瀝濾法首先將組織工程材料和致孔劑粒子制成均勻的混合物，然后利用二者不同的溶解性或揮發(fā)性，將致孔劑粒子除去，最后粒子所占有的空間變?yōu)榭紫?。所制備支架的孔隙率由粒子含量決定，孔尺寸由粒子尺寸決定。Lee等在2005年首次將電紡與鹽粒瀝濾/氣體發(fā)泡相結(jié)合，制備了具有雙重孔道結(jié)構(gòu)的聚乳酸(PLLA)納米纖維大孔支架(見圖1(a))［33］，即先用靜電紡制備出蒙脫土(MMT)增強(qiáng)的復(fù)合支架，隨后將支架與NH4HCO3/NaCl等物質(zhì)在低溫下壓鑄成膜，再分別經(jīng)氣體發(fā)泡和鹽粒瀝濾工序除去NH4HCO3和NaCl顆粒，凍干后得到孔徑在50～300 μm的大孔支架。Nam等利用類似同軸電紡的裝置，將NaCl鹽粒子從殼層噴出，PCL聚合物溶液從芯層噴出，使鹽粒子和纖維連在一起形成串珠狀的結(jié)構(gòu)［21］。通過模壓成型，得到了層層疊加的納米纖維和鹽粒子的復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而除去鹽粒子制備出了大孔支架。其中，電紡纖維層與層之間的大孔是由20～300 μm的鹽粒子被除去后得到的。

在靜電紡絲過程中，也可以用一個(gè)自動振動的篩子使鹽粒子與纖維同時(shí)沉積在接收裝置上(見圖1(b))，Kim等制得了透明質(zhì)酸/膠原(HA/collagen)纖維和 NaCl鹽粒子的復(fù)合物(見圖 1(c))，再把纖維/NaCl復(fù)合物加工成所需的形狀和尺寸。鹽粒子去掉后，支架會發(fā)生一定程度的萎縮，但仍保持了完整的大孔結(jié)構(gòu)(見圖 1(d))［25］。值得指出的是，該方法雖然可行，但在較厚支架內(nèi)部的鹽不易被除去;鹽去除后，支架會發(fā)生萎縮，力學(xué)性能差，而孔和孔之間的連通性也是個(gè)問題。

圖1 瀝濾法擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。(a)鹽浸/氣體發(fā)泡后的 PLLA/MMT復(fù)合纖維的SEM［33］;(b)靜電紡纖維和鹽粒子同時(shí)沉積的裝置;(c)纖維/鹽的復(fù)合物;(d)除掉鹽后形成的大孔［25］Fig.1 Salt/polymer leaching used to enlarge pore size of electrospun scaffolds.(a)SEM micrograph of PLLA/MMT nanocomposite scaffold by electrospinning and salt leaching/gas foaming methods［33］ ;(b)Schematic diagram of the electrospinning and salt deposition set-up;(c)Photograph of HA/collagen nanofibers/NaCl salts composite;(d)SEM image of macroporous scaffolds after leaching of the sample in Fig.1(c)［25］

類似于去掉鹽粒子一樣，選擇性地去掉復(fù)合纖維中的一種纖維的方法也被用來擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。Kidoaki等提出了同步混合電紡的概念，即用聚氨酯(SPU)和聚氧化乙烯(PEO)分別將兩個(gè)噴絲頭同時(shí)沉積到一個(gè)高速旋轉(zhuǎn)并水平運(yùn)動的接收輥上，獲得了兩種材料在單根纖維水平上能進(jìn)行相互交叉的復(fù)合纖維膜［34］。如果把PEO纖維水溶掉，就可以擴(kuò)大支架的孔徑。Baker等利用這種方法得到PCL/PEO單向復(fù)合纖維膜，去掉 PEO后，實(shí)驗(yàn)證明在一定程度上利于細(xì)胞的長入［35］，但他們選用的是取向纖維膜(其內(nèi)部孔徑比一般的無紡布要小)。Ekaputra等進(jìn)一步比較了混合電紡得到的PCL/Col－PEO無紡布纖維膜、PCL/Col微米纖維膜和PCL/Col微米纖維膜復(fù)合水凝膠這三種支架，發(fā)現(xiàn)PCL/Col－PEO無紡布纖維膜僅能略微促進(jìn)細(xì)胞長入支架，遠(yuǎn)不如另外兩種支架［36］。這是因?yàn)?，選擇性地去掉纖維法只能非常有限地增加支架的孔隙率和孔徑。

2.2 光刻蝕法

光刻蝕法用高強(qiáng)度的光(如激光)消融掉纖維，形成空隙，得到大孔纖維支架。由于其尺度上精確的可控性，已廣泛地應(yīng)用于組織工程支架的制備。光刻蝕法可以制備出規(guī)則的幾何圖案(如溝槽，見圖2(a))［37］。光刻蝕法制備出大孔纖維支架，可以促進(jìn)細(xì)胞的長入［26］。Dong等則利用一個(gè)多孔擋板(見圖2中(b)和(c))，用紫外線照射，制備出多孔纖維結(jié)構(gòu)［38］。Lootz等研究發(fā)現(xiàn)，用 CO2激光切割聚羥基丁酸酯(PHB)時(shí)造成管脆化;化學(xué)分析和分子質(zhì)量測量顯示被激光切割的材料邊緣理化性能已發(fā)生改變，加工過程會嚴(yán)重?fù)p壞材料原有的性質(zhì)，使得傳統(tǒng)的長脈沖激光在組織工程支架加工制備中的應(yīng)用受到限制［39］。以摻鈦藍(lán)寶石為代表的新一代超短、超強(qiáng)的飛秒(fs)脈沖激光器的出現(xiàn)，避免了熱擴(kuò)散的影響，同時(shí)也克服了上述傳統(tǒng)的長脈沖激光在加工生物組織工程支架上的局限［40］。但用于納米纖維時(shí)，還是會產(chǎn)生纖維之間的黏結(jié)，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

圖2 光刻蝕法擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。(a)用激光產(chǎn)生的溝槽［37］;(b)紫外線照射多孔擋板得到大孔纖維的裝置;(c)用紫外線光刻處理1 h后的靜電紡PLGA膜［38］Fig.2 Light was used to enlarge pore size of electrospun scaffolds.(a)Groove pattern formed by laser［37］;(b)Schematic diagram of UV photolithography with porous mask;(c)Electrospun PLGA nanofibers after 1 hr UV photolithography［38］

2.3 微-納米纖維復(fù)合法

靜電紡納米纖維的孔徑小，不利于細(xì)胞的長入;而微米纖維孔徑大，但纖維的比表面積小，不利于細(xì)胞的黏附。自然構(gòu)建出納米纖維和微米纖維的復(fù)合支架，就可結(jié)合這兩種纖維的優(yōu)勢，克服其各自的缺點(diǎn)。Santos等用纖維黏合工藝制備出淀粉微米纖維支架，再用靜電紡絲技術(shù)將400 nm的聚己內(nèi)酯(PCL)納米纖維灌入微米支架中，得到納米纖維和微米纖維復(fù)合支架［22］。他們的研究結(jié)果表明，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)可以長入上述復(fù)合支架的內(nèi)部，并具有生成血管的潛力(見圖3(a))。

按順序交替靜電紡納米纖維和微米纖維，可以實(shí)現(xiàn)多層納米/微米纖維的復(fù)合結(jié)構(gòu)(見圖3(b))［20］。在灌注條件下，細(xì)胞可以很明顯地長入多層納米/微米纖維復(fù)合支架的內(nèi)部，但是其納米纖維網(wǎng)還是會阻礙細(xì)胞的長入。為了解決這一問題，Thorvaldsson等提出在單根微米纖維表面沉積一層納米纖維，形成納米纖維的涂層［27］。如此接收到具有納米纖維涂層的微米纖維，可以手動地構(gòu)建成任意的孔徑和孔隙率的支架(見圖3(c))。在該支架的納米纖維涂層上，細(xì)胞可以很好地生長和長入支架的內(nèi)部(見圖3(d))。可見，這種納米纖維涂層能為細(xì)胞生長提供適當(dāng)?shù)慕佑|位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)環(huán)境。

圖3 納米纖維/微米纖維混紡擴(kuò)大纖維支架的孔徑。(a)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞長入淀粉/PCL(微米/納米)復(fù)合支架［22］;(b)使用交替電紡制備的多層微/納米纖維［20］;(c)微米纖維上有納米纖維的涂層，右上角為放大圖;(d)軟骨細(xì)胞接種到 (c)中的支架上，培養(yǎng)2周后的圖片［27］Fig.3 Hybrids of nanofibers and microfibers for enlarging pore size of electrospun scaffolds.(a)SEM micrograph of HUVEC cells on Starch/PCL nano/micro-fiber-combined scaffolds［22］;(b)Multilayered nano-and microfibers by alternative electrospinning［20］;(c)Nanofiber-coated microfibers with the insert of magnified view of a single microfiber coated with nanofibers;(d)Chondrocytes seeded on the scaffold of the microfibers coated with nanofibers，after 2 weeks of culture［27］

2.4 改變接收裝置法

在最初的靜電紡中，人們直接用金屬平板作為接收裝置，得到無紡布的纖維氈。隨后，改用滾筒來收集得到有取向的纖維膜或纖維束。現(xiàn)在，人們利用各種各樣的接收裝置來制備出適應(yīng)不同要求的纖維氈。具體到靜電紡大孔納米纖維支架，各種接收裝置被用來制備出不同孔徑大小的大孔納米纖維支架，并用于不同的組織構(gòu)建。如Li等利用緩慢旋轉(zhuǎn)的滾桶作為接收裝置，增大靜電紡纖維支架的孔徑和孔隙率，得到了孔隙率為92.4%、平均孔徑為 132.7 μm 的纖維氈［16－17］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，人類皮膚成纖維細(xì)胞長入該支架的深度可以超過100 μm，并檢測到細(xì)胞分泌出了膠原蛋白。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，該方法制備出的支架可用于皮膚組織工程［16］。改變接收裝置致孔法還包括:利用低溫接收裝置，具有特定形貌的可導(dǎo)電接收裝置或輔助電極、液體接收裝置和具有特定形貌的不可導(dǎo)電接收裝置。

2.4.1 利用低溫冷凍的接收裝置

McCann等以液氮為凝固浴，在纖維成形到達(dá)接收裝置前先經(jīng)過液氮將溶劑冷卻，紡絲射流迅速分相為溶質(zhì)相和溶劑相［41］。因此通過控制溶劑揮發(fā)速度，可以有效地控制單根纖維的孔隙率，即單根纖維的橫截面是高度多孔的結(jié)構(gòu)。該研究將接收裝置浸于低溫液體中，利用高聚物溶質(zhì)和殘余溶劑間的相分離作用，最終得到高孔隙率的聚丙烯腈(PAN)、聚己內(nèi)酯(PCL)纖維。

Simonet等利用靜電收集裝置上的冰晶層來制備大孔支架。在中空的滾筒中間裝載有冷源(如干冰或液氮)，從而在滾筒表面形成了一層冰晶(見圖4(a))［42］。利用冰晶凹凸不平的形貌，電紡纖維沉積到表面帶有冰晶的滾筒上;冰晶被除去后，會形成大孔的納米纖維結(jié)構(gòu)。Leong等利用類似的方法，制備出了 10～500 μm 的大孔纖維支架［28］。進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞可滲透到支架內(nèi)部達(dá)50 μm，而在傳統(tǒng)的靜電紡支架上沒有觀察到細(xì)胞滲透到支架內(nèi)部的現(xiàn)象。從圖4(b)可以看出，在支架的內(nèi)部，孔徑越來越小。在較厚的支架上，很難形成孔徑一致的貫通孔，這是其局限之處。

圖4 冷凍接收裝置擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。(a)冷凍滾筒表面上形成的冰晶［42］;(b)用冰晶作為接收裝置，得到PLLA大孔纖維支架［28］Fig.4 Ice crystal for electrospinning collecting device used to enlarge pore size.(a)The chilled drum with ice crystals formed on the surface［42］;(b)Electrospun scaffolds of PLLA fabricated using ice crystals［28］

2.4.2 利用液體接收裝置的干噴濕法靜電紡絲法［43］

干噴濕法靜電紡絲過程主要由注射推進(jìn)裝置、靜電發(fā)生器和凝固浴接受裝置3部分組成。最初，Smit等提出利用水浴槽收集，即把靜電紡纖維氈首先沉積到水浴中水的表面，然后被拉到水浴槽的邊緣，用旋轉(zhuǎn)圓輥接收紗線［44］。Yokoyama等將傳統(tǒng)的干噴濕法紡絲和靜電紡絲相結(jié)合，以水、50% 叔丁醇、99%叔丁醇為凝固浴，有效地分散聚集纖維，制備得到海綿狀三維結(jié)構(gòu)的聚羥基乙酸(PGA)纖維氈，并且有效控制其纖維密度，纖維直徑為200～400 nm［29］。以此干噴濕法獲得的三維結(jié)構(gòu)纖維孔隙率高達(dá)96.6%，比普通靜電紡纖維氈高11%，密度為50.8 mg/cm3，僅為普通靜電紡纖維氈的1/4。

2.4.3 改變電場控制納米纖維的沉積

利用不同的輔助電極，形成特定電場分布，可以控制電紡纖維的沉積。例如，Carnell等利用輔助電極來控制電場的形狀和大小，進(jìn)而影響纖維沉積和排列，制備出了高度取向的纖維和非編織布(見圖5)［30］。輔助電極(不銹鋼針，負(fù)電極)位于旋轉(zhuǎn)接收器(光滑表面的轉(zhuǎn)筒)上方，與正電極共同構(gòu)成了一個(gè)統(tǒng)一的球形電場(見圖5(a))。利用正、負(fù)電場相互吸引的原理，控制了電紡中常見的射流不穩(wěn)定鞭甩，形成了穩(wěn)定射流，從紡絲頭抽出了單根微/納米纖維。而纖維在到達(dá)負(fù)電極之前被旋轉(zhuǎn)接收器攔截，得到了均勻間隔的取向纖維，通過層層疊加得到非編織布。電紡聚酰亞胺(CP2)得到非編織布的孔徑25～30 μm，纖維的平均直徑是(9.9±3.3)μm;電紡聚乙醇酸(PGA)得到非編織布的孔徑7～10 μm，纖維的平均直徑是(0.91±0.4)μm(見圖5中(b)～(e))。該方法的局限是得到的纖維直徑較粗，不能很好仿生;支架的孔徑不易控制，孔徑會隨著支架的厚度而逐漸變小。

另有文獻(xiàn)報(bào)道，利用不同圖案的可導(dǎo)電接收裝置來控制纖維沉積，得到不同圖案的纖維膜［45］。其原理也是通過改變電場分布來控制電紡纖維的沉積，得到大孔支架，而纖維的排列、沉積以及圖案結(jié)構(gòu)的形成主要是由靜電力決定的。這種方法可以制備出微孔或有規(guī)律圖案結(jié)構(gòu)的支架［45－46］，在組織工程、藥物緩釋、催化和傳感等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。Vaquette等利用空心的金屬圓孔網(wǎng)(見圖6(a))作為接收裝置，制備出大孔纖維支架(見圖6(b))，并進(jìn)一步研究了細(xì)胞在該支架上的生長情況［31］。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞可以長入支架的內(nèi)部250 μm處，說明這種纖維大孔支架利于細(xì)胞的長入(見圖6(c)和(d))。但該支架孔徑過大，力學(xué)性能較差，纖維直徑也較粗(1.5 μm左右)。

圖5 利用輔助電極來擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。(a)利用負(fù)電極控制納米纖維的沉積;(b)電紡聚酰亞胺(CP2)得到的非編織布;(c)電紡聚乙醇酸(PGA)得到的非編織布;(d)是(b)的局部放大;(e)是(c)的局部放大［30］Fig.5 Auxiliary electrode used to enlarge pore size.(a)Electrospinning setup incorporating the auxiliary electrode configuration;Electrospun mats from(b)CP2(magnification 25×)and(c)PGA(magnification 100×);(d)Higher magnified(1000×)CP2 scaffolds in(b);(e)Higher magnified(2000×)PGA scaffolds in(c)［30］

2.4.4 拓?fù)湫蚊部刂萍{米纖維的沉積

圖6 利用電場來控制纖維的沉積。(a)金屬空心圓孔接收器;(b)用(a)裝置接收到的纖維膜;(c)成纖維細(xì)胞接種到(b)所述的支架上培養(yǎng)7 d后的圖像;(d)是(c)的放大，可以看到細(xì)胞明顯地長入支架的內(nèi)部(如黑色箭頭所示)［31］Fig.6 Using electric field to pattern the electrospun scaffolds.(a)“Metal”collector with round holes;(b)The round patterned electrospun scaffolds collected using(a);(c)Morphology of fibroblasts seeded on the round patterned electrospun matafter for 7 days of culture;(d)Higher magnified scaffold in Fig.6(c)，indicating that cells were able to infiltrate into the scaffold，as shown by the black arrow［31］

本實(shí)驗(yàn)室的最新研究表明，沉積的納米纖維可以一定程度上復(fù)制接收裝置表面的拓?fù)湫蚊?未發(fā)表)。不同表面形貌的接收裝置可以得到不同形貌的大孔支架。如把日常生活中常用的衛(wèi)生紙作為接收裝置，可以得到與衛(wèi)生紙表面形貌非常相似的納米纖維膜(見圖7中(a)和(b))。本方法與電場控制纖維沉積不同，因?yàn)檫x用的接收裝置都是絕緣材料。如選用一種厚度為25 mm的聚苯乙烯泡沫作為接收裝置，可得到與泡沫表面拓?fù)湫蚊蚕嗨频拇罂字Ъ?見圖7中(c)和(d))。聚苯乙烯電導(dǎo)率(σ)為10～16 S/m，電阻率為1020～1022 Ω·cm，電絕緣性能好。因此，可以認(rèn)為是由于接收裝置的表面拓?fù)湫蚊?，即材料表面的凹凸結(jié)構(gòu)，控制了電紡纖維的沉積。材料凸起的部分較易沉積纖維，材料凹陷的部分不易沉積纖維。選用具有合適表面拓?fù)湫蚊驳牟牧献鳛榻邮昭b置，就可以得到與接收裝置表面拓?fù)湫蚊蚕嗨频拇罂字Ъ?。該方法簡便快捷、成本低廉，易于控制孔徑和孔的形貌，有望成為一種潛在的組織工程三維納米纖維狀大孔支架的制備方法。

2.5 超聲法

Lee等利用超聲波來擴(kuò)大靜電紡纖維的孔徑。他們發(fā)現(xiàn)在水溶液中，對靜電紡纖維支架進(jìn)行超聲波處理，可以擴(kuò)大支架的孔徑、孔隙率和厚度［32］。支架的孔徑、孔隙率和厚度的大小取決于超聲波的強(qiáng)度和超聲處理的時(shí)間。在對支架進(jìn)行超聲處理后，發(fā)現(xiàn)支架的纖維密度降低，纖維之間的空隙增大，支架整體膨脹變厚(見圖8中(a)～(d))，利于細(xì)胞的長入。這是由于超聲波的振動使支架中的纖維相互分離，產(chǎn)生了較大空隙。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，成纖維細(xì)胞可以長入經(jīng)過超聲處理的支架內(nèi)部300 μm處(見圖8(f))，而成纖維細(xì)胞只在未經(jīng)處理的支架表面生長(見圖8(e))。在經(jīng)過超聲處理的支架中，由于細(xì)胞的遷移、增殖，使支架內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)量大為增加。該方法在制備大孔支架方面具有潛在的用途，但由于超聲波的作用，支架的機(jī)械性能會變差，這是需要改進(jìn)的地方。

圖7 拓?fù)湫蚊卜〝U(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。(a)日常生活中的衛(wèi)生紙;(b)用衛(wèi)生紙作為接收裝置，靜電紡得到納米纖維膜(可以看出，納米纖維膜和衛(wèi)生紙的拓?fù)湫蚊卜浅Ｏ嗨?;(c)用聚苯乙烯泡沫作為接收裝置，得到大孔納米纖維支架;(d)是(c)的局部放大Fig.7 Topology method(i.e.，patterning of electrospun fibers using non-conductive patterned collectors)used to enlarge pore size.(a)Lavatory paper;(b)The patterned electrospun scaffold collected using lavatory paper，indicating that the pattern of the lavatory paper was accurately copied by the electrospun fibres;(c)The patterned electrospun scaffold collected using polystyrene foam;(d)Higher magnified scaffolds in(c)

此外，有人把細(xì)胞液和紡絲液混在一起，把細(xì)胞紡到纖維中去［47］，或把電紡纖維和接種細(xì)胞交替進(jìn)行，形成細(xì)胞/纖維復(fù)合支架［48］。還有其他一些方法，如3 D打印法、冷凍干燥法等，用來制備納米纖維大孔支架。例如，Moroni等利用靜電紡和3 D打印技術(shù)制備三維納米纖維狀大孔支架，更利于細(xì)胞的黏附和鋪展［49］。此外，這種新的支架還增加了ECM蛋白質(zhì)產(chǎn)生的量，促進(jìn)了細(xì)胞更好地分化，總體而言可有效地促進(jìn)組織再生。

3 總結(jié)與展望

納米纖維具有與天然ECM近似的微觀構(gòu)造，使制備的支架能夠仿生天然ECM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn);極高的比表面積和負(fù)載生物活性成分的能力，也為活性因子的有效釋放提供了理想平臺。因而，納米纖維有望被制成理想的組織工程支架。文中綜述了各種用來擴(kuò)大靜電紡納米纖維支架孔徑的方法。但這些方法都有各自的局限，如:支架機(jī)械性能差;支架的孔徑小或孔不連通;在制備過程中，纖維出現(xiàn)腫脹或黏結(jié);孔徑過大，導(dǎo)致了很多細(xì)胞堆積在一個(gè)孔中，無法發(fā)揮納米纖維的優(yōu)勢等。當(dāng)前，納米纖維基組織工程研究所面臨的主要挑戰(zhàn)之一，就是難以制備出具有納米纖維形貌的3 D大孔支架。

目前，制備出的組織工程支架都不能構(gòu)建出較厚、較復(fù)雜的組織。傳統(tǒng)的大孔支架(不具有納米形貌)或利用層壓技術(shù)得到的較厚支架都需借助灌流、生物反應(yīng)器，才能使細(xì)胞長入支架的內(nèi)部，并保持活力。一旦把這些支架和細(xì)胞的復(fù)合物植入體內(nèi)，如果沒有充足的氧氣和養(yǎng)分，移植支架內(nèi)的細(xì)胞往往死亡。因此，利用3D大孔納米纖維支架，結(jié)合生長因子，在支架的大孔處誘導(dǎo)血管再生，也許是組織工程支架以后的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。最終，理想的組織工程支架應(yīng)能充分模擬體內(nèi)的微環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、生長和分化，使細(xì)胞在特定的位點(diǎn)、時(shí)間發(fā)揮特定的作用，再生出新的組織或器官。

圖8 超聲法擴(kuò)大靜電紡纖維支架的孔徑。常規(guī)靜電紡PLLA納米纖維支架頂部的平面(a)和橫截面(c);經(jīng)過超聲處理10 min后靜電紡PLLA納米纖維支架頂部的平面(b)和橫截面圖(d)(圖中標(biāo)尺的單位是1 mm);細(xì)胞種植7 d后，常規(guī)PLLA支架的激光共聚焦圖像(e)和經(jīng)過超聲處理的 PLLA支架的激光共聚焦圖像(f)。使用 DAPI染色，標(biāo)尺是100 mm［32］Fig.8 Highly porous electrospun nanofibrous scaffolds using ultrasonication.(a)and(c)Top surface and cross-sectional images of poly(l-lactic acid)(PLLA)nanofiber;(b)and(d)Ultrasonicated scaffolds after 10 min sonication(The unit on the ruler is 1 mm);Confocal lazer scanning microscope images of non-treated(e)and ultrasonicated POA nanofibrous scaffolds(f)at 7 days after staining with DAPI Scale bar=100 mm［32］)

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