心痛方對心肌缺血模型大鼠MPO活性及PS表達(dá)的干預(yù)作用

匡秀青，范金茹，姜益宏，陳 彤，楊金怡，那奕文

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

冠心?。–HD）是冠狀動脈粥樣硬化使血管腔阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，是動脈粥樣硬化（AS）最常見的疾病。就其發(fā)病機(jī)制而言，有氧自由基損傷、鈣超載、炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮紊亂等，其中炎癥反應(yīng)機(jī)制受到日益重視。越來越多的證據(jù)表明，局部和全身的炎癥在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。冠心病急性心肌缺血是一個急性炎癥反應(yīng)過程，中性粒細(xì)胞是缺血區(qū)最早出現(xiàn)的效應(yīng)白細(xì)胞，于缺血后30 min 開始浸潤，24～48 h達(dá)高峰[2]，髓過氧化物酶(MPO)是一種血色素蛋白，它存于嗜中性多核細(xì)胞的嗜天青顆粒和巨嗜細(xì)胞中，MPO 活性是評價中性粒細(xì)胞浸潤程度的可靠指標(biāo)[3]。PS 屬于細(xì)胞黏附分子中的選擇素家族，其通過介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞相互反應(yīng)，參與炎癥反應(yīng)及血栓形成，在冠心病發(fā)病中起重要作用。心痛方是臨床驗方，研究表明心痛方治療冠心病心絞痛療效確切，并能顯著降低冠心病患者的炎癥指標(biāo)，干預(yù)血小板、白細(xì)胞聚集及浸潤[4]。本研究通過觀察心痛方對心肌缺血大鼠模型心肌梗死面積、MPO 活性、PS 表達(dá)的影響，現(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD 大鼠，雄性，清潔級，體質(zhì)量180～200 g，鼠齡8～10 w，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，合格證號 SCXK （湘）-2009-0004。

1.1.2 藥物 心痛方（柴胡，郁金，九香蟲，瓜蔞，桃仁，白芥子）購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)心血管實驗室統(tǒng)一煎制成濃縮湯劑（含生藥0.108 g/mL）；單硝酸異山梨酯（欣康，20 mg/片，批號00958453）由魯南貝特制藥有限公司提供。

1.1.3 試劑 MPO 試劑盒由南京建成生物試劑研究所提供，PS 抗體、PBS 緩沖液等由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.1.4 儀器 DH-140 動物人工呼吸機(jī) （浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實驗廠），RM6280 多導(dǎo)生理信號采集系統(tǒng)（成都儀器廠），UV-754 紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠），MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) （北航公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠80 只，按體質(zhì)量分層，再按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組。分為A 組（假手術(shù)組）、B 組（模型組）、C 組（心痛方組）、D 組（欣康組），每組20只。

1.2.2 動物造模 參考文獻(xiàn)方法[5-6]，采用結(jié)扎冠脈左前降支造成心肌缺血模型。穿線、或結(jié)扎后即刻記錄心電圖，以心臟左室前壁呈紫紺或Ⅱ?qū)?lián)ST 段弓背向上抬高大于0.1 mv 并持續(xù)0.5 h 以上為結(jié)扎成功標(biāo)志 （S-T 段無改變者淘汰），3 h 后處死動物。

1.2.3 給藥方法 均采用灌胃法給藥，劑量均按60 kg 人體表面積換算，藥物濃度為1 mL/100 g 灌胃容量配制[7]。常規(guī)飼養(yǎng)1 周后，心痛方組按1.08 g/kg劑量給藥、欣康組按0.87 mg/kg 分別用配好的藥液灌胃，模型組和假手術(shù)組分別給予灌服同等體積生理鹽水，連續(xù)7 d，每天1 次，于第7 天灌胃30 min后進(jìn)行實驗。

1.2.4 心肌梗死面積測定 處死后摘取心臟，切片，NBT 染色液中37 ℃溫孵15 min，梗死心肌不著色，正常心肌染成藍(lán)色。數(shù)碼相機(jī)拍攝心肌切片圖像，采用圖像分析儀分別測量心肌梗死面積 （心肌梗死部分占心肌橫斷面面積的百分比）。

1.2.5 心肌組織MPO 活性測定 取心肌組織4 ℃生理鹽水洗凈，稱取100 mg 心肌組織置于試管中，加入預(yù)冷試劑二勻漿介質(zhì)，在冰浴下用高速攪拌分散劑磨成1∶20（W/V）勻漿，取0.9 mL 5%組織勻漿，分別經(jīng)37 ℃水浴15、30 min 及60 ℃水浴10 min，取出后立即在460 nm 處調(diào)光徑1 cm，蒸餾水調(diào)零，分光度測定各管OD 值，最后按以下公式計算出MPO 活性，計算公式為：

MPO 單位/克濕重=(測定管OD 值-對照管OD值)／[11.3×取樣量(g)]。

1.2.6 心肌組織PS 表達(dá)測定 取各組缺血區(qū)域心肌組織切片，采用免疫組化SABC 法染色封片鏡檢。黃褐色或棕色顆粒為陽性產(chǎn)物，在顯微鏡下用醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)測量陽性反應(yīng)物的平均光密度（AOD）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心痛方對各組大鼠心肌梗死面積的影響

心痛方組、欣康組、模型組可見較明顯心肌梗死，其中模型組最為顯著，梗死面積最大，假手術(shù)組未見梗死，3 組心肌梗死面積與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表明造模成功。心痛方組與模型組比較，梗死面積較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01），說明心痛方能縮小心肌梗死面積；欣康組與模型組比較，梗死面積較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；心痛方組與欣康組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明心痛方和欣康均能縮小大鼠心肌梗死面積。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠心肌缺血模型心肌梗死面積比較 （n=8，±s）

表1 各組大鼠心肌缺血模型心肌梗死面積比較 （n=8，±s）

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別假手術(shù)組模 型 組心痛方組欣 康 組藥物劑量（g/kg）— —1.08 8.7×10-4心肌梗死面積（%）0 29.48±8.11*20.21±5.39*△△22.94±7.68*△

2.2 心痛方對心肌缺血大鼠模型MPO 活性的影響

心痛方組、欣康組、模型組與假手術(shù)組比，MPO活性明顯升高，其中模型組升高最顯著，說明大鼠心肌急性缺血時MPO 活性升高，表明髓過氧化物酶在大鼠急性心肌缺血中起到一定的促進(jìn)作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；心痛方組、欣康組與模型組比較，MPO 活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01，P＜0.05），心痛方組與欣康組比較，MPO 活性降低更明顯，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；說明心痛方、欣康能抑制心肌MPO 活性，而心痛方作用更強(qiáng)。結(jié)果見表2。

2.3 心痛方對心肌缺血大鼠模型PS 表達(dá)的影響

與模型組比較，心痛方組、欣康組缺血心肌PS表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明心痛方、欣康能抑制PS 在缺血心肌中的表達(dá)；心痛方組與欣康組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠心肌缺血模型心肌MPO 活性、PS 表達(dá)比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠心肌缺血模型心肌MPO 活性、PS 表達(dá)比較 （n=8，±s）

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別假手術(shù)組模 型 組心痛方組欣 康 組PS 表達(dá)（AOD）0.09±0.03 0.51±0.04*0.19±0.03*△0.20±0.03*△藥物劑量(g/kg)— —1.08 8.7×10-4 MPO 活性（U/g）0.31±0.09 3.23±0.72*1.31±0.49*△△2.04±0.80*△

3 討論

心痛方主要由柴胡、瓜蔞、白芥子、桃仁、郁金、九香蟲等藥組成，是依據(jù)全國名老中醫(yī)王行寬教授“雜病治肝”理論演化而來，以疏肝豁痰化瘀法立方。方中柴胡為君藥，疏肝理氣，取“氣行則血行”之意，使“肝氣通則心氣和”。瓜蔞、白芥子、桃仁為臣藥，三者合用，豁痰化瘀、行氣止痛以治標(biāo)實；栝蔞性寒，既可防白芥子辛溫傷陰之弊，又防治肝郁化火之勢；郁金為佐，佐君藥疏肝解郁，助臣藥行氣活血化瘀；九香蟲為使，走竄絡(luò)脈，理氣止痛而不傷胃，并能理肝胃之氣、行膈脘之滯以助脾胃之健運(yùn)，以絕生痰之源。故總方功效以疏肝解郁理氣為重，化痰與祛瘀并舉，冀脈絡(luò)通暢，氣血安和，常用于治療肝郁痰瘀氣滯證冠心病心絞痛患者。

本研究結(jié)果表明：心痛方能縮小急性心肌缺血大鼠心肌梗死面積；抑制心梗心肌MPO 活性及PS表達(dá)，在抑制MPO 活性方面心痛方組優(yōu)于欣康組。

MPO 是心肌損傷過程中中性粒細(xì)胞浸潤的特異性指標(biāo)，吳氏等觀察大鼠心肌缺血再灌注模型中中性粒細(xì)胞與心肌損傷程度的相關(guān)性，表明心肌損傷的程度與心肌內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)呈正相關(guān)，證明聚集在缺血區(qū)的中性粒細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的氧自由基，對組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用[8]。

PS 在血栓形成過程中起始動作用，放大炎癥反應(yīng)，并通過與P 選擇素糖蛋白配體相互作用誘導(dǎo)促凝血顆粒產(chǎn)生，使機(jī)體進(jìn)入血栓前狀態(tài)，從而參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，與動脈粥樣斑塊的形成及其穩(wěn)定性密切相關(guān)[9]。通過干預(yù)中性粒細(xì)胞的浸潤、降低PS表達(dá)及其黏附作用可能是心痛方治療缺血性心肌病變的作用機(jī)制之一。

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