響應面法優(yōu)化樺褐孔菌總酚的超聲提取工藝

李 峰，尚 磊，俞力超，徐秀泉

1江蘇大學附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001;2江蘇大學京江學院;3江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江212013

響應面法優(yōu)化樺褐孔菌總酚的超聲提取工藝

李 峰1，尚 磊2，俞力超1，徐秀泉3*

1江蘇大學附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001;2江蘇大學京江學院;3江蘇大學藥學院，鎮(zhèn)江212013

以樺褐孔菌總酚得率為指標，在單因素試驗基礎上，根據(jù)中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面設計方法對超聲提取過程中影響總酚得率的乙醇濃度、超聲溫度及時間進行優(yōu)化。結果表明樺褐孔菌總酚超聲提取的最佳工藝條件為:采用55%乙醇，料液比1∶30，在52℃下超聲提取40 min，在此最佳條件下，總酚得率為19.42 mg/g，實驗結果與模型預測值相符，相對誤差為+0.78%。

樺褐孔菌;總酚;超聲提取;響應面設計

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)，又稱chaga，從16世紀以來就是俄羅斯、東歐、波蘭、芬蘭等國家民間廣泛應用的藥用真菌，用于防治各種疑難雜癥，日本研究人員高度評價這種民間藥用真菌為“萬能藥”［1］。樺褐孔菌中主要含有多糖、酚類及三萜類化合物，其中酚類化合物是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種藥理活性［2-5］。但對樺褐孔菌總酚的提取工藝研究較少。響應面法(response surfacemethodology，RSM)是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具，將多因子實驗中因素與指標的相互關系用多項式近似擬合，依此可對函數(shù)的響應面進行分析，研究因子與響應面之間、因子與因子之間的相互關系［6］。為深入開發(fā)該藥用真菌，本文在單因素試驗的基礎上，采用 Box-Behnken中心組合設計方法，響應面法優(yōu)化樺褐孔菌總酚的超聲提取工藝條件，為樺褐孔菌的深入開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，DHG-9145鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)，KQ—250DB型超聲波儀(昆明市超聲儀器有限公司)，BS 110 S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。沒食子酸對照品，F(xiàn)olin-Ciocaltean試劑購自Sigma公司，其它試劑均為國產分析純試劑。樺褐孔菌購自吉林省千百匯土特產有限公司，經江蘇大學藥學院宋晶博士鑒定為藥用真菌Inonotus obliquus干燥菌核，粉碎過篩備用。

2 實驗方法

2.1 總酚的測定［7］

2.1.1 沒食子酸標準曲線的繪制

精密稱取沒食子酸對照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇適量溶解，定容至刻度，搖勻，取上述溶液2.5 mL定容至25 mL量瓶中，即得100 μg/mL沒食子酸標準溶液。分別精密量取該標準溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入Folin-Ciocaltean試劑0.5 mL，振搖1 min，再加入20%碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，加蒸餾水至刻度，在室溫放置2小時。以相應的試劑溶液為空白，按分光光度法，在750 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得A= 0.0147C-0.0017，R2=0.9994，結果表明沒食子酸在濃度10～100 μg/mL范圍內與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.1.2 樣品溶液的制備

準確稱取1.00 g樺褐孔菌粉末于100 mL具塞錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，在規(guī)定溫度下超聲提取規(guī)定時間，離心，定容至25 mL得樣品溶液，移取樣品溶液適量按照標準曲線項下測定樣品吸光度，計算總酚得率。

采用單因素試驗考察乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、料液比對樺褐孔菌總酚提取率的影響，依據(jù)單因素實驗結果確定因素水平范圍，利用Design-Expert Software軟件為輔助手段設計響應面試驗。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇濃度對總酚提取率的影響

固定料液比1∶30，超聲溫度50℃，超聲時間20 min，考察不同乙醇濃度對樺褐孔菌總酚提取率的影響。結果表明在20%～60%乙醇濃度范圍內，總酚提取率隨乙醇濃度的增加而有顯著提高，在乙醇濃度60%時提取率最大，隨著乙醇濃度的進一步增加，總酚提取率顯著下降。因此選擇60%左右乙醇作為較佳的提取溶劑。

3.1.2 超聲提取時間對總酚提取率的影響

固定料液比1∶30，超聲溫度50℃，乙醇濃度60%，考察不同超聲提取時間對樺褐孔菌總酚提取率的影響。結果表明從10到30 min總酚提取率隨提取時間的延長而增加，在30 min時達到最大值。再延長超聲時間，總酚得率趨于平穩(wěn)，有下降的趨勢，因此選擇超聲時間在30 min左右為宜。

3.1.3 超聲提取溫度對總酚提取率的影響

固定料液比1∶30，乙醇濃度60%，超聲時間20 min，分別在考察不同超聲溫度對樺褐孔菌總酚提取率的影響。結果表明在20～50℃范圍內，隨溫度提高總酚得率提高，說明較高的溫度對酚化合物的溶出是有利的。當超過50℃后，總酚得率有所下降，選擇50℃左右提取較為合適。

3.1.4 料液比對總酚提取率的影響

固定乙醇濃度60%，超聲時間20 min，超聲溫度50℃，按照1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入提取溶劑，考察不同料液比對樺褐孔菌總酚提取率的影響。結果表明隨料液比的增加，總酚提取率相應增高，這是由于溶劑用量增加，可以使藥材與溶劑接觸面積增大，并且能夠增大固液濃度差，有利于擴散速度的提高。當料液比大于1∶30后，總酚的提取率基本保持不變，本著經濟節(jié)約原則，選擇料液比1∶30為好。

3.2 響應面優(yōu)化總酚的超聲提取條件

3.2.1 響應面實驗安排及結果

根據(jù)中心組合設計原理，綜合單因素實驗結果，以乙醇濃度、超聲提取溫度、超聲時間三個因素為自變量，總酚的提取得率為響應值，設計3因素3水平共17個實驗點的響應面分析實驗。因素水平分析選取見表1。實驗方案與結果見表2，其中12個為析因實驗，5個為中心實驗。

表1 響應面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in extraction experiments of total phenols

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Experimental designs and extraction results of total phenols

2 －1 1 0 18.45 18.57 3 0 1 1 18.14 18.40 4 －1 0 1 18.35 18.22 5 0 －1 1 18.04 18.24 6 0 0 0 18.64 18.62 7 0 0 0 18.59 18.62 8 －1 0 －1 15.01 15.09 9 －1 －1 0 16.68 16.87 10 0 －1 －1 13.60 13.52 11 0 0 0 18.60 18.62 12 1 1 0 17.42 17.23 13 0 0 0 18.56 18.62 14 1 －1 0 15.21 15.08 15 0 1 －1 17.50 17.30 16 0 0 0 18.72 18.62 17 1 0 －1 14.05 14.18

3.2.2 建立模型方程與顯著性檢驗

應用Design-Expert 8.0.5軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)與樺褐孔菌總酚之間的二次多項回歸方程:

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表3。

由表3回歸方差顯著性檢驗表明，一次項各因素對總酚得率的線性效應極顯著;二次項各因素對總酚提取率的曲面效應極顯著;比較各因子間交互作用提取時間和提取溫度間交互作用極顯著，乙醇濃度與提取溫度交互作用高度顯著，乙醇濃度與提取時間交互作用不顯著，各因素交互作用的響應面立體分析圖和等高線圖見1-3。在本實驗設計范圍內，回歸方程顯著性檢測P＜0.0001，極顯著，模型的確定系數(shù)為0.9981，說明該模型能解釋99.81%響應值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，試驗誤差小，證明應用響應曲面法優(yōu)化的提取工藝提取樺褐孔菌總酚是可行的。

表3 樺褐孔菌總酚提取率方差分析結果Table 3 ANOVA for the regression model and respective terms

3.3 提取工藝條件的確定

為確定各因素的最佳取值，利用Design-Expert軟件分析后，得出回歸模型存在最大值點，(A、B、C)的代碼值為(-0.24、0.97、0.18)。與之對應的實測值為乙醇濃度(A)=55.2%，提取時間(B)= 39.7 min，提取溫度(C)=51.8℃，此時酚提取得率的最大估計值Y=19.30 mg/g。為實際操作方便，選取乙醇濃度=55%，提取時間=40 min，提取溫度=52℃，進行3次平行驗證實驗，樺褐孔菌總酚得率為 19.42 mg/g，與理論值的相對偏差為+0.78%說明實驗值與理論值有較好的擬合性。

4 結論

將單因素實驗和響應面分析法結合對超聲輔助提取樺褐孔菌總酚的工藝條件進行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件:采用55%乙醇，料液比1∶30，在52℃下超聲提取40 min，在此最佳條件下，總酚得率為19.42 mg/g，實驗結果與模型預測值相符。響應面分析法可以很好的對樺褐孔菌總酚超聲提取工藝進行優(yōu)化，試驗結果對藥用真菌樺褐孔菌的深入研究開發(fā)具有很好的理論指導意義。

1 Liang QL(梁清樂)，Wang QY(王秋穎)，F(xiàn)an JY(樊錦燕) et al..A survey of Inonotus obliquus.Chin Tradit Herbal Drugs(中草藥)，2005，36:623-625.

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3 Zheng WF，Zhang MM，Zhao YX.NMR-based metabonomic analysis on effect of light on production of antioxidant phenolic compounds in submerged cultures of Inonotus obliquus. Bioresour Technol，2009，100:4481-4487.

4 Nakajima Y，Nishida H，Matsugo S.Cancer Cell Cytotoxicity of Extracts and Small Phenolic Compounds from Chaga Inonotus obliquus(persoon)Pilat.J Med Food 2009，12:501-507.

5 Park YM，Won JH，Kim YH.In vivo and in vitro anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of the methanol extract of Inonotus obliquus.J Ethnopharmacol，2005 101:120-128.

6Wang HW(汪洪武)，Liu YQ(劉艷清)，Wang YH(汪遠紅).Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids from Leaves of the Artocarpus heterophyllus by Response Surface Methodology.Chin Med Mat(中藥材) 2011 34:1125-1129.

7 Wang J，Sun BG，Cao YP，et al.Optimisation of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran.Food Chem，2008，(106):804-808.

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Phenols from Inonotus obliquus by Response Surface Methodology

LI Feng1，SHANG Lei2，YU Li-chao1，XU Xiu-quan3*1Affiliated Hospital of Jiangsu University Zhenjiang 212001，China;2School of Jingjiang Jiangsu University;3School of Pharmacy Jiangsu University Zhenjiang 212013，China

With the Extraction rate of total phenols as response value the ethanol concentration ultrasonic-assisted extraction temperature and extraction time were optimized by response surface methodology with 3 factors and 3 levels based on single factor experiments.The optimal extraction conditions were ethanol concentration 55%liquid-material ratio of 1∶30 extraction temperature 52℃ and extraction time 40 min for extraction total phenols from Inonotus obliquus.Under these conditions the maximal yield of total phenols reached 19.42 mg/g which was agreed with model predictions for the relative error of+0.78%.

Inonotus obliquus;total phenols;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

1001-6880(2012)10-1458-05

2011-12-26 接受日期:2012-03-12

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目(SH2010033);江蘇大學大學生科研立項項目(Y09A098)

*通訊作者 Tel:86-511-85038403;E-mail:xxq781026@sohu.com

R284.2

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