響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化仙鶴草總多酚的超聲提取工藝

徐秀泉，李 峰，湯 建，許 源

1江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013;2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化仙鶴草總多酚的超聲提取工藝

徐秀泉1*，李 峰2，湯 建1，許 源1

1江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江212013;2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江212001

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對影響超聲輔助提取仙鶴草總多酚得率的主要因素(超聲溫度、料液比和乙醇濃度)進(jìn)行優(yōu)化，建立了影響因素與總多酚之間的函數(shù)關(guān)系。獲得最佳工藝條件為:71%乙醇，料液比1∶24，超聲提取溫度60℃，提取時(shí)間20 min。在此最佳條件下，總多酚得率為3.56%，試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值相符。

仙鶴草;總多酚;超聲提取;響應(yīng)面設(shè)計(jì)法

植物多酚是植物次生代謝產(chǎn)物中的重要類型之一，主要由黃酮、單寧等物質(zhì)構(gòu)成，因其具有顯著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突變活性而引起人們的廣泛關(guān)注［1］。仙鶴草為薔薇科龍芽草屬植物龍芽草Agrimonia pilosa Ledeb.的全草，在我國具有悠久的藥用歷史，主要用于治療衄血、咯血、尿血、便血、崩漏等各種出血證［2］。其中酚類物質(zhì)為仙鶴草酚A～E，山萘酚、槲皮素及其苷類是其抗氧化、抗炎、抗腫瘤的主要有效成分［3，4］，因此研究仙鶴草多酚化合物的提取工藝對仙鶴草的深入開發(fā)利用具有重要的意義。

近年來，陳優(yōu)生［5］等采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化了仙鶴草總黃酮的提取工藝，趙立芳［6］等采用單因素實(shí)驗(yàn)法考察了影響仙鶴草鞣質(zhì)提取得率的主要因素，為中藥材仙鶴草的利用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但采用超聲提取仙鶴草中有效成分的工藝還未見報(bào)道。超聲波具有強(qiáng)大的傳質(zhì)作用和空化作用，使溶劑分子迅速滲透到組織細(xì)胞中，與溶質(zhì)充分接觸，可以顯著提高有效成分的提取率，廣泛用于多酚等化合物的提取過程中［7，8］。本文在單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法優(yōu)化仙鶴草總多酚超聲提取工藝參數(shù)，為更好地開發(fā)該傳統(tǒng)中藥提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

仙鶴草購自江蘇鎮(zhèn)江九泰醫(yī)藥有限公司，干燥、粉碎過16目篩備用。

試驗(yàn)試劑:沒食子酸，F(xiàn)olin-Ciocaltean試劑購自Sigma公司，藥用乙醇購自國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);DHG-9145鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司);KQ-250DB型超聲波儀(昆明市超聲儀器有限公司);BS 110 S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取沒食子酸對照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，加乙醇適量溶解，定容至刻度，搖勻，取上述溶液2.5 mL定容至25 mL溶液即得100 μg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑0.5 mL，振搖1 min，再加入20%碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，加溶劑至刻度，在室溫放置2小時(shí)。以相應(yīng)的試劑溶液為空白，按分光光度法，在750 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=0.0147X-0.0017，R2=0.9994，結(jié)果表明沒食子酸在濃度10～100 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.2 仙鶴草總多酚的提取及含量測定

準(zhǔn)確稱取1.000 g仙鶴草粉末，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液20 mL，在一定溫度超聲提取規(guī)定時(shí)間，離心后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測定樣品吸光度，計(jì)算多酚得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 響應(yīng)面試驗(yàn)安排及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，結(jié)合響應(yīng)面分析方法，綜合單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，固定提取時(shí)間20 min，以料液比、乙醇濃度、超聲溫度三個(gè)因素為自變量，總多酚的提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。對提取溫度、料液比、乙醇濃度作如下變化:X1=(x1–50)/10，X2=(x2–20)/50，X3=(x3–60)/20，因素水平分析選取見表1。實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表2，其中12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of RSM test

料液比S o l i d -l i q u i d r a t i o ( g / m L ) x 2 1∶1 5 1∶2 0 1∶2 5乙醇濃度C o n c e n t r a t i o n ( % ) x 3 4 0 6 0 8 0

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of RSM test

2.1.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 7.1.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到超聲溫度(X1)、料液比(X2)、乙醇濃度(X3)與仙鶴草總多酚之間的二次多項(xiàng)回歸方程:

對上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 仙鶴草總多酚提取率方差分析結(jié)果Table 3 AVONA of total polyphenols extraction rate of Agrimonia pilosa Ledeb.

＊＊＊P＜0.001，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

由表3回歸方差顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)超聲提取時(shí)間、溫度對總多酚得率的線性效應(yīng)極顯著，乙醇濃度對多酚得率的線性效應(yīng)顯著;二次項(xiàng)料液比、乙醇濃度對總多酚提取率的曲面效應(yīng)極顯著;比較各因子間交互作用不顯著。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)回歸方程顯著性檢測P=0.0001，極顯著，模型的確定系數(shù)為0.9809，說明該模型能解釋98.09%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取工藝提取仙鶴草總多酚是可行的。

2.1.3 響應(yīng)曲面分析

圖1 超聲溫度和料液比對總多酚提取得率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots and contour plots of multual-influence of extraction temperature and material-liquid ratio on extraction rate

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析超聲溫度、料液比和乙醇濃度對仙鶴草總多酚提取率的影響，如圖1～3所示。等高線的形狀可反應(yīng)交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1～3中可以看出，各因素間的交互作用不顯著。從等高線圖可以看出極值條件應(yīng)在圓心處，三因素對仙鶴草總多酚的提取都有顯著的影響，超聲提取溫度的影響最為顯著，隨溫度提高，總多酚得率隨之增大，表現(xiàn)為等高線更為陡峭;料液比和和乙醇濃度次之，表現(xiàn)為等高線曲線較平滑。

2.1.4 提取工藝條件的確定

為驗(yàn)證仙鶴草總多酚超聲提取模型方程的適用性，對回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即三個(gè)主要因素的最佳水平值，分別為: X1=1、X2=0.81、X3=0.55，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為:71%乙醇，料液比1∶24，超聲提取溫度60℃，提取時(shí)間20 min，預(yù)測仙鶴草總多酚得率為3.61%。按照最佳試驗(yàn)條件重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算多酚得率，求其平均值為3.56%，實(shí)際與預(yù)測的多酚得率較為接近，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面分析方法適用于仙鶴草總多酚的超聲提取工藝的優(yōu)化。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法對超聲輔助提取仙鶴草總多酚的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件: 71%乙醇，料液比1∶24，超聲提取溫度60℃，提取時(shí)間 20 min，在此條件下仙鶴草總多酚得率為3.56%。超聲提取方法簡單，具有提取效率高、時(shí)間短、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的提取仙鶴草多酚的方法。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Polyphenols from Agrimonia pilosa Ledeb.by Response Surface Methodology

XU Xiu-quan1*，LI Feng2，TANG Jian1，XU Yuan11College of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China;2Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212001，China

Response surface methodology(RSM)was used to optimize ultrasonic-assisted extraction for total polyphenols from Agrimonia pilosa Ledeb.based on single-factor experiment.The main factors extraction temperature，liquid-material ratio and ethanol concentration were determined.The relationship between influencing factors and response values was established.The optimum extraction conditions were as follows:the extracting solvent was 71%ethanol，solid-liquid ratio was 1∶24，extracting temperature was 60℃，and extracting time was 20 min.Under these conditions，the maximal yield of total polyphenols reached 3.56%，which was well matched with the predicted content.

Agrimonia pilosa Ledeb.;total polyphenols;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

1001-6880(2012)01-0114-04

2011-03-18 接受日期:2011-06-24

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項(xiàng)目(SH2010033)

*通訊作者 Tel:86-511-85038403;E-mail:xxq781026@sohu.com

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