長(zhǎng)效土霉素注射液在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及相對(duì)生物利用度研究

廖雪玲，張炳旭，丁煥中

(1.上海公誼獸藥廠，上海 201401;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

四環(huán)素類抗生素用于治療感染性疾病已有半個(gè)世紀(jì)。由于口服給藥的方便性，四環(huán)素類抗生素臨床實(shí)踐具有廣泛的使用性[1]。此類抗生素是通過抑制蛋白質(zhì)的合成來抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，其機(jī)制是藥物與細(xì)菌30s亞基核糖體結(jié)合，從而阻止氨基酰-tRNA結(jié)合到核糖體的A位點(diǎn)，進(jìn)而阻止氨基酸多肽鏈的合成[2]。

土霉素為四環(huán)素類廣譜抗生素，20世紀(jì)50年代開始用于臨床，對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、衣原體、霉形體、螺旋體、放線菌和某些原蟲皆有抑制作用[3]。土霉素不僅廣泛用于畜禽，還有少數(shù)被批準(zhǔn)用于水產(chǎn)的抗生素，療效顯著[4]。美國于20世紀(jì)80年代推出長(zhǎng)效土霉素注射液，抗菌效果顯著延長(zhǎng)。近年來國內(nèi)也有長(zhǎng)效土霉素注射液相關(guān)研究，報(bào)道了不同溶媒的土霉素注射液在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)[5]。本文對(duì)一種長(zhǎng)效土霉素注射液在豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和相對(duì)生物利用度進(jìn)行研究，以期為臨床合理使用該劑型提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品 30%長(zhǎng)效土霉素注射液，批號(hào)071012，上海公誼獸藥廠。20%長(zhǎng)效土霉素注射液，批號(hào)70453009E，美國輝瑞(動(dòng)物保健品)有限公司。土霉素標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)H010105。EDTA·2Na、草酸、三氟乙酸、檸檬酸、高氯酸、85%磷酸、磷酸氫二鈉等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭＜状?、乙腈均為色譜純，DIMA TECHNOLOGY INC。超純水為符合 GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

1.2 儀器 高效液相色譜儀:Waters 2695分離系統(tǒng)、在線負(fù)壓脫氣機(jī)、2487紫外檢測(cè)器，配備四元泵、脫氣泵、色譜工作站、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，美國Waters公司。色譜柱:Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，不銹鋼柱，大連依利特公司。電子分析天平，F(xiàn)A2004N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。臺(tái)式高速離心機(jī)，Centrifuge5804，德國 EPPENDORF公司。旋渦混合器，XW-80A，上海青浦滬西儀器廠?？烧{(diào)微量移液器，Eppendorf Research型，10 ～100 μL，20 ～200 μL，100 ～1000 μL，500 ～5000 μL，德國 EPPENDORF 公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 健康長(zhǎng)白×大白×杜洛克三元閹公豬(landrace×large white×duroc)7頭，50日齡，體重(19.17±2.15)kg。自由采食、飲水，飼喂不加任何抗菌藥物的全價(jià)配合飼料。

1.4 給藥及采樣 動(dòng)物按隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分組。按20 mg/kg體重單次頸部肌肉注射30%長(zhǎng)效土霉素注射液和對(duì)照土霉素注射液 (市售美國輝瑞20%長(zhǎng)效土霉素注射液)。給藥前測(cè)定兩種制劑的藥物含量。給藥前采取空白血漿，給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、168、192 h 分別經(jīng)前腔靜脈采集血液樣品，每次采血5 mL左右，分離血漿，-20℃保存待測(cè)。

1.5 樣品處理 樣品解凍，搖勻。準(zhǔn)確吸取1.0 mL血漿，加入200 μL的變性劑(EDTA-Mcllvaine緩沖液和高氯酸的混合液，體積比4∶1)，漩渦30 s，混勻，靜置5 min后12000 r/min離心15 min，吸取上清液經(jīng)0.22 μm針式濾膜過濾，取50 μL濾液進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.6 色譜條件 流動(dòng)相:A液(含0.6 mmol/L EDTA·2Na，10 mmol/L 草酸，0.15%三氟乙酸)∶B液(乙腈)=70∶30(V/V);色譜柱:Hypersil BDS C18不銹鋼柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);進(jìn)樣量20 μL;流速1.0 mL/min;柱溫35℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)357 nm。

1.7 回收率和變異系數(shù) 將定量的標(biāo)準(zhǔn)液加入豬空白血漿中，配得低(0.1 μg/mL)、中(0.5 μg/mL)和高(2 μg/mL)三個(gè)樣品濃度，按1.5項(xiàng)樣品處理方法處理樣品，進(jìn)行HPLC測(cè)定;同時(shí)分別取濃度為0.1、0.5、2 μg/mL土霉素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1 mL進(jìn)行HPLC測(cè)定，每一濃度樣品重復(fù)5次，以峰面積比計(jì)算，求其回收率。每批(日內(nèi))作5次重復(fù)，共作5個(gè)批次(日間)。計(jì)算每批內(nèi)和每批間的色譜峰面積平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤，求得各變異系數(shù)。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在2 mL的離心管中各加入1 mL空白血漿，再依次加入20 μL土霉素系列濃度(2.5～500 μg/mL)，旋渦混勻，使得各樣品中血漿的藥物濃度為0.05～10 μg/mL，按1.5項(xiàng)樣品處理方法處理樣品，進(jìn)行HPLC測(cè)定。以土霉素色譜峰面積(A)為橫坐標(biāo)，藥物濃度(C)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.9 樣品測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集的血漿樣品經(jīng)處理后，進(jìn)行HPLC測(cè)定。以測(cè)得樣品中藥物峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算藥物濃度。所得藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用MCPKP藥動(dòng)學(xué)計(jì)算機(jī)程序處理，計(jì)算出每頭動(dòng)物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，然后計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件適用性 在本試驗(yàn)色譜條件下，土霉素與其他組分分離良好，色譜峰峰形較佳，測(cè)得土霉素保留時(shí)間為6.2 min左右。

2.2 回收率和變異系數(shù) 按上述處理方法，在0.1、0.5、2.0 μg/mL 濃度下，平均回收率在(77.4±2.3)% ～(96.4±2.4)%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均不超過10.00%。由此可知，此血漿處理方法和液相檢測(cè)方法可靠，重復(fù)性好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 血漿中土霉素線性回歸方程為 C=0．000042A-0．0144(r=0.9999)，線性范圍為0.05～10 μg/mL。按信噪比S/N=3為檢測(cè)限(LOD)，S/N=10為定量限(LOQ)，求得本方法測(cè)定血漿中土霉素檢測(cè)限為0.02 μg/mL，定量限為0.05 μg/mL。

2.4 血藥濃度和主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 30%長(zhǎng)效土霉素注射液與20%長(zhǎng)效土霉素注射液藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)的血藥濃度和主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1和表2。土霉素在豬體內(nèi)符合一級(jí)吸收二室模型。

表1 30%長(zhǎng)效土霉素注射液與20%長(zhǎng)效土霉素注射液給藥后的血藥濃度 μg/mL

續(xù)表

表2 30%長(zhǎng)效土霉素注射液與20%長(zhǎng)效土霉素注射液給藥后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(x±s)

3 討論

豬肌肉注射30%長(zhǎng)效土霉素注射液后吸收迅速(吸收半衰期為0.088 h，達(dá)峰時(shí)間為0.609 h)，峰濃度高(4.956 μg/mL)，消除半衰期長(zhǎng)(52.499 h)，有效血藥濃度維持時(shí)間長(zhǎng)(給藥后72 h平均血藥濃度約為0.3 μg/mL)，相對(duì)生物利用度高(105.368%)。生物學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(t檢驗(yàn))，與20%長(zhǎng)效土霉素注射液相比，30%長(zhǎng)效土霉素注射液給藥后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(吸收半衰期、消除半衰期、峰濃度、達(dá)峰時(shí)間、藥-時(shí)曲線下面積)無顯著差異。

本試驗(yàn)長(zhǎng)效土霉素注射液在豬體內(nèi)消除半衰期(t1/2β)為52.499 h，這與之前報(bào)道長(zhǎng)效土霉素注射液在豬體內(nèi)的消除半衰期(t1/2β)大致相符[6-7]。另外，長(zhǎng)效土霉素在其他種類動(dòng)物消除半衰期(t1/2β)為:山羊，15.1 h;綿羊，14.4 h;犢牛，23.9 h;奶牛，6.964 h(乳汁);奧尼羅非魚，60.312 h;班節(jié)對(duì)蝦，23.372 h[8-11]。由此可見，長(zhǎng)效土霉素藥動(dòng)學(xué)特征雖存在種屬差異性，但半衰期都相對(duì)延長(zhǎng)，具有長(zhǎng)效特點(diǎn)，這與土霉素使用的有機(jī)溶媒有關(guān)。早有研究報(bào)道，使用α-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺為溶媒的土霉素注射液明顯具有長(zhǎng)效性[12]。

本試驗(yàn)按20 mg/kg體重給藥后，72 h平均血藥濃度約為0.3 μg/mL，高于豬的常見敏感菌MIC。因此，對(duì)于臨床敏感菌感染，建議30%長(zhǎng)效土霉素注射液按20 mg/kg體重劑量3～4 d給藥1次，連續(xù)給藥2次，重癥酌情加倍。

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