復(fù)方煤焦油酸溶液對口蹄疫病毒殺滅效果試驗(yàn)

劉 瀾，張俊儒，張 強(qiáng)，莫 云，杜繼紅，張 雁，文 波，5，楊秀玉

(1.北京大北農(nóng)動物保健技術(shù)研究中心，北京 101407;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730050;3.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107;4.北京市朝陽區(qū)種植業(yè)養(yǎng)殖業(yè)服務(wù)中心，北京 100018;5.韶山大北農(nóng)動物藥業(yè)有限公司，湖南韶山 411300;6.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄類動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，也是人畜共患的傳染病?？梢鹩仔笏劳?、產(chǎn)奶量下降、肉品質(zhì)下降、動物的生產(chǎn)性能降低，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，全世界每年由此造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)百億美元[1]。國際獸醫(yī)局(OIE)將其列為A類動物疫病的第一位，我國也將其列為一類動物疫病之首。在自然狀態(tài)下FMDV可經(jīng)消化道感染，經(jīng)呼吸道感染是最主要的傳播途徑，動物、人員及運(yùn)輸工具等均可機(jī)械性地散播病毒[2]。一旦發(fā)現(xiàn)疫情，徹底、科學(xué)的消毒是控制疫情傳播的最好方法。復(fù)方煤焦油酸溶液主要成分為高沸點(diǎn)煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等，具有高效、超強(qiáng)廣譜、超級穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[3]。目前已在世界范圍內(nèi)廣泛用于口蹄疫、禽流感等烈性傳染病的控制。本文通過試驗(yàn)考察復(fù)方煤焦油酸溶液對口蹄疫病毒的殺滅效果，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 消毒劑:韶山大北農(nóng)動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方煤焦油酸溶液，批號11030701;對照藥物，國外某公司生產(chǎn)的復(fù)方煤焦油酸溶液，批號1011LA0043;O型口蹄疫病毒ELISA檢測試劑盒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供;實(shí)驗(yàn)動物:4日齡吮乳乳鼠(清潔級昆明小鼠)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物場提供。

病毒的制備和稀釋:O型口蹄疫乳鼠組織毒(LD50=1×10-8.0，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供)，用0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋成1∶500倍病毒懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 安全性試驗(yàn) 安全性試驗(yàn)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。將復(fù)方煤焦油酸溶液用去離子水分別做1∶100、1∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500、1 ∶600 倍稀釋，然后分組皮下注射4日齡乳鼠，每只乳鼠注射0.2 mL復(fù)方煤焦油酸溶液稀釋液，每組注射5只，同時設(shè)陰性對照組，陰性對照組乳鼠每只注射0.2 mL去離子水。每組設(shè)置4個平行。注射后連續(xù)觀察72 h，記錄乳鼠發(fā)病死亡情況。另以對照藥物替代復(fù)方煤焦油酸溶液，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn) 殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。根據(jù)安全性試驗(yàn)結(jié)果，將復(fù)方煤焦油酸溶液用去離子水分別做1∶250、1∶300、1∶350、1∶400稀釋，然后依次與1 ∶500倍稀釋的 O型口蹄疫乳鼠組織毒等量混合，室溫作用30 min后皮下注射4日齡乳鼠，每只乳鼠背部皮下注射0.2 mL消毒劑-病毒混合液，每組注射5只;同時設(shè)病毒對照組，每組4只乳鼠，每只乳鼠皮下注射0.2 mL 1∶1000倍稀釋的病毒液;設(shè)健康對照組，健康對照每組2只，每只乳鼠皮下注射0.2 mL去離子水。每組設(shè)置5個平行。注射后連續(xù)觀察7 d，記錄情況。另以對照藥物替代復(fù)方煤焦油酸溶液，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 病毒抗原檢測 將各組發(fā)病死亡乳鼠的胴體加0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)研磨后制成1∶10(W/V)懸液，健康對照組在觀察7 d后處死，同樣將胴體研磨后制成1∶10(W/V)懸液，懸液放置4℃過夜，6000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行ELISA檢測。ELISA檢測方法:用包被緩沖液稀釋FMDV O型兔血清至工作濃度(1∶200)，加入包被酶標(biāo)板，置于4℃過夜;用PBS洗滌后加入試劑盒陽性對照和上述樣品，置于37℃旋轉(zhuǎn)振蕩器中振蕩50 min;再用PBS洗滌后加入1∶100稀釋的FMDV O型豚鼠抗血清，封板后置于37℃旋轉(zhuǎn)振蕩器中振蕩40 min;酶標(biāo)板洗滌后加1∶400稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃振蕩孵育40 min;洗滌后加入鄰苯二胺(OPD)溶液(含H2O2)，37℃避光振蕩孵育15 min，加1.25 mol/L硫酸終止液，混勻后在492 nm下讀取OD值。

1.3 評判標(biāo)準(zhǔn) 消毒劑安全性判定標(biāo)準(zhǔn):乳鼠不死亡，判為安全，反之為不安全。消毒劑殺滅病毒效果判定標(biāo)準(zhǔn):1)病毒對照組乳鼠在接種病毒后發(fā)病死亡，并從乳鼠體內(nèi)檢測到口蹄疫病毒增殖，且健康對照組試驗(yàn)期間無異常表現(xiàn)，全部健康活潑，視為試驗(yàn)成立;2)消毒劑試驗(yàn)組乳鼠在試驗(yàn)期間無異常表現(xiàn)，全部健康活潑，判定消毒劑該濃度下產(chǎn)品有效;3)消毒劑試驗(yàn)組有乳鼠死亡，并從乳鼠體內(nèi)檢測到口蹄疫病毒增殖，判定消毒劑該濃度下產(chǎn)品無效。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性試驗(yàn)結(jié)果 消毒劑對乳鼠的安全性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方煤焦油酸溶液和對照藥物在1∶100～1∶400倍稀釋下接種乳鼠均有死亡，在1∶500和1∶600倍稀釋下均未見接種乳鼠死亡，陰性對照未發(fā)現(xiàn)接種乳鼠死亡。表明1∶500倍以上稀釋濃度的復(fù)方煤焦油酸溶液和對照藥物皮下注射乳鼠不會產(chǎn)生致死反應(yīng)，乳鼠安全。安全性試驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示。

表1 復(fù)方煤焦油酸溶液對動物的安全性測定結(jié)果

表2 對照藥物安全性測定結(jié)果

2.2 殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)安全性試驗(yàn)結(jié)果，對殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)的消毒劑濃度設(shè)置為1 ∶500、1 ∶600、1 ∶700、1 ∶800 倍稀釋，同時設(shè)置陽性對照和健康對照。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方煤焦油酸溶液和對照藥物在1∶500和1∶600倍稀釋下，接種乳鼠均未死亡，全部健康活潑;而在1∶700和1∶800倍稀釋下，接種乳鼠均有死亡，且1∶800倍稀釋較1∶700倍稀釋死亡乳鼠顯著增加。表明1∶500和1∶600倍稀釋濃度的復(fù)方煤焦油酸溶液和對照藥物可能滅活了O型口蹄疫乳鼠組織毒，而1∶700和1∶800倍稀釋濃度的復(fù)方煤焦油酸溶液和對照藥物可能沒有有效滅活O型口蹄疫乳鼠組織毒，導(dǎo)致部分乳鼠感染FMD而死亡。復(fù)方煤焦油酸溶液和對照藥物對口蹄疫病毒的殺滅效果試驗(yàn)結(jié)果如表3、表4所示。

表3 復(fù)方煤焦油酸溶液殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果

表4 對照藥物殺滅口蹄疫病毒試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病毒ELISA檢測結(jié)果 在對FMD病毒ELISA檢測中，攻毒用1∶500倍稀釋的O型口蹄疫乳鼠組織毒OD值為0.306;健康對照組樣品的平均OD值為0.008，表明健康對照組乳鼠未感染FMD病毒;陽性對照組的平均OD值為1.600，表明陽性對照組乳鼠均感染FMD病毒，且病毒在乳鼠體內(nèi)大量增殖。實(shí)驗(yàn)各組中死亡乳鼠樣品的OD值詳見表5，經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計分析，復(fù)方煤焦油酸溶液1∶700、1 ∶800 及對照藥物 1 ∶700、1 ∶800 的OD值與1∶500倍稀釋的乳鼠組織毒OD值差異極顯著(P＜0.01)，表明實(shí)驗(yàn)中各死亡乳鼠被FMD病毒感染，且病毒在乳鼠體內(nèi)大量增殖。

表5 FMD病毒ELISA檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

口蹄疫病毒屬小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，是一種無囊膜的病毒。國內(nèi)外對其抵抗力的研究中，一般認(rèn)為FMDV對環(huán)境中的不利因素有較強(qiáng)的抵抗力，在4℃比較穩(wěn)定，低溫條件下可長期存活，對熱和干燥有一定的抵抗力，對酚類、醇類等消毒劑不敏感[4]。但FMDV對酸很敏感，通過調(diào)節(jié)pH值能達(dá)到滅活口蹄疫病毒的效果，在pH 6.5的緩沖溶液中，在4℃條件下14 h內(nèi)，可滅活 90%;pH 5.5時，1 min滅活90%[5]?？刂瓶谔阋咭咔榈膫鹘y(tǒng)的消毒方法有10～20 g/L的氫氧化鈉、10 mL/L的甲醛溶液、50～500 g/L的碳酸鹽等浸泡或噴灑污染物，但這些消毒劑的腐蝕性和刺激性強(qiáng)[6-8]。

復(fù)方煤焦油酸溶液由高沸點(diǎn)煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等復(fù)方配制而成，具有低pH值(pH值在2.0～2.4之間)、超強(qiáng)的表面粘著和滲透性及生物安全等優(yōu)點(diǎn)，目前已被世界各地廣泛選擇用于流行病的防控。在法國、英國、美國被政府指定為口蹄疫專用消毒劑，在韓國也被用于口蹄疫的控制，在泰國被用于禽流感的控制等。我國1999年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定復(fù)方煤焦油酸溶液用于畜禽舍及器具的消毒。由Antec International-A Dupont Company生產(chǎn)的復(fù)方煤焦油酸溶液(FarmFliud S)自20世紀(jì)進(jìn)口到我國以來，被規(guī)模豬場推崇應(yīng)用于動物欄舍及環(huán)境的消毒和口蹄疫疫情的防控。國內(nèi)也出現(xiàn)眾多的類似產(chǎn)品，但因其在工藝技術(shù)等方面千差萬別，導(dǎo)致產(chǎn)品在消毒效力、安全性等方面也存在較大的差異。北京大北農(nóng)動物保健技術(shù)研究中心和韶山大北農(nóng)動物藥業(yè)有限公司通過對復(fù)方煤焦油酸溶液配方及工藝技術(shù)等多方面的深入研究，攻克了復(fù)方煤焦油酸消毒劑制備技術(shù)難點(diǎn)，極大地提高了復(fù)方煤焦油酸消毒劑在消毒效力、安全性等方面特性。

上述試驗(yàn)表明，此煤焦油酸消毒劑1∶600倍稀釋液在室溫條件下與O型口蹄疫乳鼠組織毒作用30 min，能100%殺滅口蹄疫病毒，可用于口蹄疫病毒污染的動物欄舍、運(yùn)載工具及環(huán)境等消毒，其消毒效力、安全性等方面與國外同類產(chǎn)品(對照藥物)相當(dāng)。

[1]高 飛，孫國斌，張金鳳.國外口蹄疫流行現(xiàn)狀分析及防治策略[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2006，21(1):76-80.

[2]盧曾軍，劉在新.口蹄疫病毒研究概況[J].中國獸醫(yī)科技，2003，33(2):69-74.

[3]李玉欣，林紹榮.高沸點(diǎn)煤焦油酸消毒劑[J].畜禽業(yè)，2006，189:42-43.

[4]葉培根，張松柏.規(guī)?；i場防治口蹄疫的消毒技術(shù)中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2005年學(xué)術(shù)年會論文集獸醫(yī)部分[C].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:741-743.

[5]王超英，翟國元，孫彩琴，等.復(fù)合過硫酸氫鉀類消毒劑殺滅口蹄疫病毒消毒效果的試驗(yàn)中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004年學(xué)術(shù)年會論文集[C].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004:1180-1183.

[6]劉在新，謝慶閣.口蹄疫防治技術(shù)的研究和發(fā)展[J].中國獸醫(yī)科技，2001，31(5):18-21.

[7]楊傲冰，杜偉賢，李偉軍.12種消毒劑對豬O型口蹄疫病毒的殺滅效果[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，1999，24(2):18-19.

[8]朱海霞，張 強(qiáng)，李 健，等.不同類型消毒劑對口蹄疫病毒殺滅效果的試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2009，41(4):107-108.