氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

何方洋，馮月君，吳 鵬，馮 靜，岳新榮，韓京朋

(北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是20世紀(jì)中葉從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌中提取制得的一類廉價(jià)高效的廣譜抗生素[1-2]，對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都有很好的抑制作用，因此一度被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)中[3]。但是動物源性食品中的氯霉素藥物殘留隨著食物鏈被人體長期攝入，可引發(fā)各種危害和多種疾病。輕者破壞人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)，菌群失調(diào)，使人體產(chǎn)生耐藥菌珠，給以后患病使用抗生素治療帶來不良影響;氯霉素過敏體質(zhì)的人會出現(xiàn)過敏反應(yīng)，危及健康[4]。嚴(yán)重時(shí)可干擾骨髓細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并抑制幼稚細(xì)胞DNA合成，導(dǎo)致粒細(xì)胞減少，引發(fā)再生障礙性貧血、溶血、紫癱等惡性疾病[5]。氯霉素殘留問題對人類健康構(gòu)成巨大的潛在威脅，已引起國際組織和世界上許多國家的高度重視[6]，歐美等發(fā)達(dá)國家均在法規(guī)中對CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)作出了嚴(yán)格的規(guī)定[7]。我國農(nóng)業(yè)部2001年公告第24號文件規(guī)定，在馬肝、雞肉等中氯霉素的殘留限量為不得檢出，要求其檢測限量為1 ng/g;2002年公告第235號文件進(jìn)一步要求，氯霉素及其鹽、酯在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出[8]。

為適應(yīng)更高的檢測標(biāo)準(zhǔn)，檢測技術(shù)水平必須相應(yīng)的提高，因此氯霉素檢測技術(shù)一直是近十年來國內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱門項(xiàng)目之一[9]。氯霉素的檢測方法分為物理化學(xué)法和免疫化學(xué)法，前者有液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法(MS)等，后者主要是酶免法(ELISA)，檢測的靈敏度均達(dá)到ppb(μg/kg)級別[10-11]。當(dāng)前主流的檢測方法是液相色譜法——我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所使用的方法以及ELISA。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者又研發(fā)出液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、液相色譜電噴霧電離質(zhì)譜法(LC-EITMS)、微生物分析等物理檢測新方法[12]，同時(shí)對ELISA方法的應(yīng)用也有了進(jìn)一步研究。

化學(xué)發(fā)光分析法是一種有效的微量和痕量分析法[13]，與放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(ELA)相比，RIA和ELA檢測時(shí)間一般為75～120 min，化學(xué)發(fā)光方法檢測時(shí)間一般為18 min，靈敏度與RIA屬于同一檢測水平，檢測限可達(dá)10-12～10-20mol[14-15]。獸藥殘留中的化學(xué)發(fā)光免疫分析，不僅具有免疫反應(yīng)的特異性，而且具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏性，如果能將兩項(xiàng)技術(shù)有效的結(jié)合起來，那么將會開啟一項(xiàng)十分有發(fā)展前景的分析監(jiān)測技術(shù)。建立穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，是進(jìn)行化學(xué)發(fā)光試劑盒的研制的基礎(chǔ)，同時(shí)對于嚴(yán)把食品安全的檢驗(yàn)環(huán)節(jié)有重要的意義。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平2000SBL(美國Setra);磁力攪拌器90-2(上海振榮科學(xué)儀器有限公司);微量移液器，單道 20～200 μL、100～1000 μL，多道50 ～300 μL(美國Thermo);氮吹儀DSY-Ⅲ(北京金科精華苑科技有限公司);QL-901漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);低速離心機(jī)Anke TDL-40B(上海安亭科學(xué)儀器有限公司 );CentroLB960微孔板式發(fā)光儀(德國Berthold);Opti-plateTM化學(xué)發(fā)光板(Perkin Elmer);生化培養(yǎng)箱DHP-600(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)。

1.2 試劑 氯霉素及其類似物標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfe公司);牛血清白蛋白 BSA、卵清蛋白OVA(Sigma公司);鹽酸、Pd/C催化劑、二甲基甲酰胺(DMF)、三丁胺、氯甲酸異丁酯、人糖化白蛋白(GA)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);辣根過氧化物酶 (美國Jackson公司);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(北京望爾生物技術(shù)有限公司);魯米諾發(fā)光底物液(Hyclone Pierce);其他有關(guān)化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法

2.1 抗原的合成

2.1.1 免疫原的合成 將氯霉素溶于甲醇中，加入5%的Pd/C催化劑，通入氫氣，保持一定壓力，室溫反應(yīng)2 h，過濾除去Pd/C，蒸干溶劑得到淡黃色黏稠液體，即得氯霉素半抗原。將上述得到的目標(biāo)物在0～5℃下，用鹽酸調(diào)pH值為1～2，攪拌下滴加0.1～1 mol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀試紙變藍(lán)，再滴加0.1～1 mol/L尿素溶液，使淀粉碘化鉀試紙變淺藍(lán)，再加0.1～1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為7～9，得到清液，作為溶液A備用。量取溶液A 21.8 mL加入DMF 3 mL中，4℃預(yù)冷10 min，加入三丁胺，混勻;并加入氯甲酸異丁酯，4℃攪拌20 min。稱取71.5 mg BSA溶于50%的DMF 10 mL中，4℃預(yù)冷。用1 mol/L NaOH調(diào)BSA的pH至8。將配制好的溶液A迅速加入BSA中，4℃攪拌反應(yīng)4 h。取氯霉素半抗原30 mg用1.5 mL水溶解;取50%的GA 10 μL加入前述半抗原溶解液中，室溫下攪拌反應(yīng)18 h;取BSA 100 mg用1.5 mL水稀釋后加入前述半抗原溶解液中;反應(yīng)過夜后加入24 mg NaBH4反應(yīng)3 h;用三蒸水透析48 h，即得免疫原[16]。

2.1.2 包被原的合成 按2.1.1步驟反應(yīng)，取氯霉素半抗原30 mg，OVA 100 mg，合成CAP-OVA，供包被用。

2.2 單克隆抗體的制備 用上述制備出的免疫原(CAP-BSA)按150 μg/只，以生理鹽水溶解免疫復(fù)合物與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫復(fù)合物與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫1次，融合前3 d以免疫復(fù)合物100 μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫1次。按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后在45 s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用HT培養(yǎng)基半換液，9 d時(shí)候進(jìn)行全換液，得到雜交瘤細(xì)胞，將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測定效價(jià)，凍存;并取8～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5 mL/只，7～10 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106～2×106/只，7～10 d后抽取小鼠腹水，離心取上清，測定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆肹17]。

2.3 酶標(biāo)單克隆抗體制備 稱取5 mg辣根過氧化物酶溶于0.5 mL去離子水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL，混勻置冰箱30 min，取出加入0.16 mol/L乙二醇水溶液0.5 mL，于室溫放置30 min后加入含5 mg純化單克隆抗體的水溶液1 mL，混勻并裝透析袋對0.05 mol/L pH 9.5碳酸緩沖液緩慢攪拌透析6 h使之結(jié)合，吸出后加NaBH4溶液0.2 mL，置冰箱2 h。將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放30 min后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02 mol/L pH 7.4 PBS中，并對之透析過夜，次日再離心除去不溶物，即得酶-抗體結(jié)合物，用0.02 mol/L pH 7.4 PBS加至5 mL進(jìn)行測定后冷凍干燥保存。

2.4 氯霉素化學(xué)發(fā)光檢測方法的建立[18]

2.4.1 酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液將氯霉素包被原稀釋成10 μg/mL，每孔加入 100 μL，37 ℃溫育2 h，傾去包被液，然后在每孔中加入150 μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內(nèi)液體，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌1次，拍干。

2.4.2 確定抗原抗體最佳稀釋比例 采用方陣滴定法確定包被原與單克隆抗體的最佳工作濃度。將包被抗原按 160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列稀釋度包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)氯霉素單克隆抗體按 1 ∶1000、1 ∶2000、1 ∶4000、1 ∶8000、1 ∶16000、1 ∶32000、1 ∶64000、1 ∶128000、1∶512000的倍數(shù)進(jìn)行稀釋，用方陣法確定抗原抗體的最佳稀釋比例。

2.4.3 氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的繪制 向用氯霉素偶聯(lián)包被原包被的酶標(biāo)板微孔中加入濃度分別為 0、20.0、60.0、180.0、540.0和1620.0 pg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50 μL，再加入酶標(biāo)氯霉素單克隆抗體工作液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃恒溫箱中反應(yīng)15 min，倒出孔中液體，重復(fù)洗板5次，拍干。每孔加入化學(xué)發(fā)光顯色液100 μL，輕輕振蕩混勻，3 min后用微孔板式發(fā)光儀測定每個(gè)孔的發(fā)光強(qiáng)度。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光強(qiáng)度平均值(RLU)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)品)的發(fā)光強(qiáng)度值(RLU0)再乘以100%，得到百分發(fā)光強(qiáng)度值，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)的半對數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)，百分發(fā)光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

2.4.4 檢測與其他藥物的交叉反應(yīng)率 用于抗體交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與氯霉素結(jié)構(gòu)或者功能相似的藥物。按試劑盒程序操作，但加入的競爭物分別為不同的氯霉素類似物，制作抑制曲線，根據(jù)線性方程計(jì)算各競爭物50%抑制濃度(IC50)。交叉反應(yīng)率(CR%)即為抗體對氯霉素的IC50與抗體對競爭物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)，按下式進(jìn)行計(jì)算:

2.4.5 豬肉中氯霉素殘留檢測 稱取(3.0±0.05)g去除脂肪的均質(zhì)樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL乙酸乙酯，用振蕩器振蕩10 min，4000 r/min，室溫(20 ～25 ℃)離心 10 min;移取4 mL上層有機(jī)相(約相當(dāng)于2 g的樣本)至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?加入1 mL正己烷，用渦旋儀渦動30 s，再加1 mL磷酸鹽緩沖液，用渦旋儀渦動1 min轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，4000 r/min，室溫(20～25℃)離心15 min;除去上層有機(jī)相，取下層50 mL用于分析。

2.4.6 最低檢測限、回收率及精密度 取20份空白樣品，按照2.4.5項(xiàng)步驟處理后所建立的ELISA方法進(jìn)行檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對應(yīng)的濃度。以20份空白樣品對應(yīng)的樣品濃度平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本檢測的最低檢測限。

另取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品分別對豬肉樣品按照10、20 pg/g進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。分別抽取3個(gè)批次試劑盒進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品2個(gè)平行，計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度。

3 結(jié)果

3.1 包被抗原及HRP-CAP單抗最佳稀釋倍數(shù)經(jīng)方陣滴定法確定包被抗原濃度為10 μg/mL，HRP-CAP單抗稀釋倍數(shù)為1∶16000時(shí)，試驗(yàn)效果較理想(R2=0.9948、IC50=59.911 pg/mL)，因此，確定抗原包被濃度為10 μg/mL，HRP-CAP單抗的稀釋倍數(shù)為1∶16000。

3.2 競爭反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 按上述實(shí)驗(yàn)方法加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記抗體后測定室溫下反應(yīng)10、15、20以及25 min后加入發(fā)光溶液，測定0標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值，結(jié)果表明在反應(yīng)15 min時(shí)發(fā)光值最大(圖1)，因此本試劑盒選取反應(yīng)時(shí)間為15 min。

圖1 反應(yīng)時(shí)間與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系

3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 氯霉素化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖2，IC50值為59.911 pg/mL，線性范圍為20～1620 pg/mL。

圖2 氯霉素試劑盒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3.4 試劑盒特異性 氯霉素單克隆抗體對其類似物的交叉反應(yīng)率見表1?？梢钥闯觯搯慰寺】贵w對其他幾種類似物的交叉反應(yīng)率均較低，其對氯霉素具有較好的特異性。

表1 氯霉素試劑盒特異性試驗(yàn)

3.5 最低檢測限 對20份空白豬肉樣本進(jìn)行檢測，測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為該方法對實(shí)際樣本的最低檢測限，結(jié)果見表2。由表得出空白豬肉樣品平均值為2.65 pg/g，標(biāo)準(zhǔn)差為2.20，最低檢測限為9.3 pg/g。

表2 該方法對豬肉的最低檢測限 pg/g

3.6 準(zhǔn)確度與精密度 ELISA法的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)來表示。取豬肉樣本分別添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品至10、20 pg/g，對樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，分別計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度，檢測結(jié)果見表3。

表3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

由于氯霉素是小分子物質(zhì)，沒有免疫原性，所以必須連接到大分子載體上產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[19-20]，本試驗(yàn)將氯霉素分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯(lián)，合成免疫原和包被原[21-24]。本研究根據(jù)間接競爭反應(yīng)原理建立快速檢測CAP的一步式化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化，其最佳反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為10 μg/mL，包被溫度為37℃，反應(yīng)2 h，HRP-CAP單抗最佳稀釋倍數(shù)為 1 ∶16000，競爭反應(yīng)15 min，洗滌液為 pH 7.4、含0.05%吐溫-20的PBST溶液。本研究所制備的單克隆抗體對氯霉素具有很高的特異性(IC50=59.911 pg/mL)，并且對氯霉素抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，對其他氯霉素類似物的交叉反應(yīng)率較低，該試劑盒的線性范圍為20～1620 pg/mL，靈敏度為20 pg/mL，最低檢測限為10 pg/mL，樣本添加回收率在 76.3% ～94.7%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在3.1% ～8.7%之間，批間變異系數(shù)在6.0% ～6.2%之間，完全能夠滿足對于氯霉素殘留檢測的要求。

2002年1月，美國食品與藥品管理局(FDA)公布了禁止在進(jìn)口動物源性食品中使用氯霉素;歐盟的進(jìn)口食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定“氯霉素含量標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出?！蔽覈r(nóng)業(yè)部也于2002年12月明文規(guī)定在所有動物的食品中不得檢出含有CAP及其鹽、酯等。其“不得檢出”的含義是氯霉素含量在1 ppb以下，即含量在十億分之一(ppb)級以下;德國部分州的特殊檢測標(biāo)準(zhǔn)為0.2 ppb。本試驗(yàn)方法的各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足檢測要求。經(jīng)檢驗(yàn)，比常規(guī)ELISA的檢測效果更好，且可縮短反應(yīng)時(shí)間約60 min?？梢姡砸徊绞交瘜W(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測動物組織中的CAP殘留更符合快速檢測的要求，實(shí)現(xiàn)了對CAP殘留的簡便、快速、精確檢測。

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