芩花注射劑的制備工藝及主藥含量測(cè)定

劉 挺，李繼昌，蔣國(guó)政，韓振興

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

芩花注射劑主要用于防治豬支原體感染。它以黃芩和金銀花為主藥，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1];金銀花為常用的清熱解毒藥，含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素、芳樟醇等，主要成分綠原酸具有明顯的抑菌作用。中藥提取方法有水提堿溶液法、水提石硫醇沉淀、堿醇膠凍法、醇提水沉酸化法、脫脂醇提法、超聲提取法、超濾法、樹(shù)脂吸附法、分級(jí)提取法、微波提取法和水提取醇沉淀法等[2-5]。本試驗(yàn)采取水提醇沉法提取中藥有效成分，確定最佳制備工藝，并采用HPLC法進(jìn)行綠原酸、黃芩苷的含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Waters E2695高效液相色譜儀、Waters 2998二極管檢測(cè)器由美國(guó)Waters公司生產(chǎn);Hypersil BDS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)由大連依利特分析儀器有限公司提供。

1.1.2 藥物與試劑 黃芩、金銀花、百部等中藥材購(gòu)于黑龍江省藥材公司，黃芩苷對(duì)照品(CAS NO:21967-41-9)、綠原酸對(duì)照品(CAS NO:327-97-9)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，吐溫-80、苯甲醇、冰醋酸為分析純。

1.2 芩花注射劑的制備工藝

1.2.1 單因素試驗(yàn)

1.2.1.1 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響 取5份等量的藥粉(每份藥粉含有黃芩、金銀花、百部、甘草、紫菀)，固定每次提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶10，分別浸提1次、2次、3次、4次、5次，記錄黃芩苷和綠原酸的提取量。

1.2.1.2 提取時(shí)間/次對(duì)提取量的影響 取5份等量的藥粉，固定提取次數(shù)為2次，料液比1∶10，每次提取時(shí)間分別取 0.5、1、1.5、2、2.5 h，記錄黃芩苷和綠原酸的提取量。

1.2.1.3 料液比對(duì)提取量的影響 取5份等量的藥粉，固定提取時(shí)間1 h，提取2次，分別以料液比為1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 提取，記錄黃芩苷和綠原酸的提取量。

1.2.2 正交試驗(yàn) 主藥的有效成分為黃芩苷和綠原酸，由于綠原酸提取量較低，而黃芩苷提取量相對(duì)較高，因此以綠原酸提取量確定正交試驗(yàn)結(jié)果。正交設(shè)計(jì)L4(23)因素水平如表1所示。

表1 中藥提取工藝因素水平正交設(shè)計(jì)L4(23)表

1.2.3 注射劑制備流程 藥物提取→70%酒精醇沉置于4℃冰箱24 h→抽濾濃縮→90%酒精醇沉置于4℃冰箱24 h→抽濾濃縮至無(wú)醇味→定容使每毫升藥液含1 g生藥→pH調(diào)至8.5→0.5%活性炭煮沸30 s→抽濾→加入0.5%吐溫-80、1%苯甲醇、0.1%硫代硫酸鈉等附加劑→pH調(diào)至8.5→0.22 μm濾器過(guò)濾封裝→流通蒸汽滅菌。

1.3 主藥含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇(A)-1%冰醋酸(C)(A+C=100%)，等度洗脫，黃芩苷測(cè)定中A ∶C=50 ∶50，吸收波長(zhǎng) 276 nm，流速 1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL;綠原酸測(cè)定中A ∶C=20∶80，吸收波長(zhǎng)330 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 溶液的制備

1.3.2.1 對(duì)照溶液的制備 精密稱取3.2 mg黃芩苷對(duì)照品，用50%甲醇定容于25 mL容量瓶中，并分別配制成濃度為 12.8、25.6、38.4、51.2、64 μg/mL的對(duì)照品母液。精密稱取4.8 mg綠原酸對(duì)照品，用50%甲醇定容于25 mL容量瓶中，分別配制成濃度為 19.2、38.4、57.6、76.8、96 μg/mL 的對(duì)照品母液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取0.5 mL自制芩花注射液，用50%甲醇定容于50 mL容量瓶中，作為綠原酸供試品。精密吸取5 mL自制芩花注射液，用50%甲醇定容于10 mL容量瓶中，作為黃芩苷供試品。供試品進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.3 線性關(guān)系考察 分別取系列濃度的黃芩苷和綠原酸對(duì)照品母液，在A∶C=50∶50和A∶C=20∶80條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。

1.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芩苷、綠原酸對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定樣品中黃芩苷、綠原酸的峰面積。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)5份樣品，按供試品溶液制備方法制備進(jìn)樣，記錄峰面積。

1.3.7 加樣回收率 取2.5 mL自制芩花注射液，用50%甲醇定容于50 mL容量瓶中(測(cè)得藥液濃度28.654 μg/mL)，分別精密吸取1～5 mL該藥液于5支10 mL容量瓶中，再取5份濃度為64 μg/mL黃芩苷對(duì)照品2 mL，分別加入以上5支容量瓶中并定容，作為黃芩苷回收率樣品。精密吸取芩花注射液0.5 mL，用50%甲醇定容于50 mL容量瓶中(測(cè)得藥液濃度30.974 μg/mL)，精密吸取該藥液3～7 mL于5支10 mL容量瓶中，再取5份濃度為76.8 μg/mL綠原酸對(duì)照品2 mL分別加入以上5支容量瓶中并定容，作為綠原酸回收率樣品。分別取10 μL過(guò)膜后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.3.8 樣品含量測(cè)定 按照黃芩苷和綠原酸的色譜條件，對(duì)黃芩苷和綠原酸供試品進(jìn)行依次測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)提取2次時(shí)的主藥含量與多次提取的已無(wú)顯著差別，因此選定提取次數(shù)為1次和2次進(jìn)行正交試驗(yàn)較為方便。

圖1 提取次數(shù)對(duì)提取量的影響

2.1.2 提取時(shí)間/次對(duì)提取量的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2，顯示提取時(shí)間為1 h含量較高，故以1 h和1.5 h作為正交試驗(yàn)因素。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響

2.1.3 料液比對(duì)提取量的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3，顯示10倍量水和15倍量水主藥量各有不同，含量較為接近，由于后期制備注射劑過(guò)程中濃縮較麻煩，為方便制備，選擇8倍量水和10倍量水進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)提取量的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知，對(duì)綠原酸含量影響大小的因素依次為B＞A＞C，最佳組合為A1B2C2，即采用10倍水量、煎煮2次、每次1 h的提取方式較好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 主藥含量測(cè)定

2.3.1 線性關(guān)系考察 以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷與綠原酸的回歸方程分別為 Y=0．04X-14．78(r2=0．999)，Y=0．04X-10．73(r2=0．998);分別在 12.80 ～64.00、19.20～96.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)呈良好線形關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 測(cè)得黃芩苷峰面積RSD=0．28%，綠原酸峰面積RSD=0.43%，表明所選方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 測(cè)得樣品中黃芩苷、綠原酸的峰面積:黃芩苷 RSD=1．48%，綠原酸 RSD=2.19%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 經(jīng)測(cè)，黃芩苷RSD=2．94%，綠原酸RSD=2.62%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率測(cè)定 黃芩苷和綠原酸的平均加樣回收率分別為103.13%和100.37%。

2.3.6 樣品含量測(cè)定 芩花注射液樣品中黃芩苷和綠原酸的含量分別為3.292、0.860 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

中藥注射劑是近30年發(fā)展起來(lái)的一種新型制劑，它的確切療效已經(jīng)為臨床所證實(shí)[6-7]。芩花注射劑在藥物提取過(guò)程中采用水提醇沉的方法，該方法方便、價(jià)格低廉。利用單因素試驗(yàn)篩選出正交試驗(yàn)的因素和水平，通過(guò)正交試驗(yàn)的方法，以綠原酸提取量為依據(jù)確定了煎煮的條件。按照藥典中注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，注射劑中不能存在鞣質(zhì)、樹(shù)脂、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在醇沉濃度90%時(shí)符合該標(biāo)準(zhǔn)，將雜質(zhì)均除去，但對(duì)藥物含量有一些影響。由于藥物提取完成后，高溫會(huì)對(duì)藥物成分有影響，因此使用活性炭吸附雜質(zhì)時(shí)，煮沸時(shí)間定為30 s到1 min為宜，最后藥液pH調(diào)節(jié)至8.5時(shí)澄清度最佳，此時(shí)黃芩苷溶解度較好。附加劑的添加起到了抗菌、抗氧化、助溶及止疼的作用。采用現(xiàn)代制劑的新技術(shù)和新方法，選擇藥理活性強(qiáng)、毒副作用小的傳統(tǒng)中藥處方將其制成中藥注射劑，并制定嚴(yán)格的質(zhì)量控制方法，可以使其達(dá)到安全、有效、穩(wěn)定、可控的標(biāo)準(zhǔn)，有效發(fā)揮中藥防病治病的作用[8]。采用液相色譜法測(cè)定藥物含量方便快捷。

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