反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體對裸鼠膀胱癌生物學(xué)行為的影響

李然偉，魏 巍，劉祿成，溫都蘇，陳秀玲

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科，吉林 長春130041）

膀胱癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人民的生命與健康。目前越來越多的證據(jù)表明，微小RNA（microRNA，miRNA）是調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的重要分子［1，2］。miRNA－21是 miRNA 家族的成員之一，在進(jìn)化上高度保守，被認(rèn)為具有癌基因的功能［3］。腫瘤抑素（Tumstatin）是一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子與細(xì)胞凋亡啟動子，具有2個抗腫瘤活性區(qū)，不僅通過特異性地抑制血管內(nèi)皮蛋白合成導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使腫瘤新生血管形成受阻，還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，從而遏制腫瘤生長，因此被普遍認(rèn)為是一種抑癌基因［4，5］。研究證實，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟，多基因參與的復(fù)雜過程，這其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。腫瘤的發(fā)生是由于這一平衡體系失調(diào)所致。據(jù)此推測，研究反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體在裸鼠膀胱癌生物學(xué)行為中的作用，對臨床膀胱癌的研究治療也可能具有極其重要的實用意義。鑒于尚未見到有關(guān)這方面的文獻(xiàn)報道，現(xiàn)將我們的實驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人膀胱癌T24細(xì)胞株購自中科院上海分院細(xì)胞所；BALB／C雌性裸鼠20只，10－12周齡，體重（30±2）g，由中科院上海實驗動物中心提供；原位腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡檢查試劑盒及即用型HIGH－SABC免疫試劑盒購自Boster；反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體由本研究室制備保存［6，7］。

1.2 研究方法 ① 動物模型的制備：參照文獻(xiàn)［7］，用0.25%胰酶消化，收集對數(shù)生長期的T24培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個／ml。自尿道插入22G靜脈留置針套管，針芯輕劃膀胱底部粘膜，使黏膜損傷范圍大小約0.5×0.5cm后立即經(jīng)套管灌注1.5 ml細(xì)胞懸液。② 灌注后第28天，采用活體動物體光學(xué)成像技術(shù)挑選出腫瘤大小基本一致的10只成瘤裸鼠，放入同一飼養(yǎng)籠內(nèi)，然后隨機抓取，編為1－10號，分籠單獨飼養(yǎng)，單號鼠為治療組，雙號鼠為對照組。治療組灌注反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體30μg（1.5ml），1周1次，共4次；對照組則每次用等劑量的PBS，治療后第7天分別通過活體動物體光學(xué)成像技術(shù)測量腫瘤的長徑和短徑，以長（mm）和寬（mm）表示腫瘤大小，隨后處死所有裸鼠。盆腔淋巴結(jié)在目測篩選后再行組織病理學(xué)檢查以最終確定微轉(zhuǎn)移情況。③ 應(yīng)用SABC免疫組化方法并結(jié)合MTT和TUNEL技術(shù)分別檢測T24細(xì)胞株增殖與凋亡。取5μm厚的石蠟切片，依次脫蠟水化，新鮮配制的3%H2O2（甲醛溶液配制）作用15min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，蛋白酶K在37℃消化10min暴露抗原，標(biāo)準(zhǔn)枸櫞酸鹽緩沖液（0.1mol，PH6.0）煮沸3min修復(fù)抗原，按Boster原位細(xì)胞增殖與凋亡檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，Tris緩沖鹽溶液沖洗2次，每次5min，然后DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化、脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光鏡觀察。光鏡下見細(xì)胞核呈棕黃著色的為凋亡細(xì)胞，有黃褐著色的為增殖細(xì)胞。每張切片在光鏡下（×200）隨機選取3個視野，共約1500個瘤細(xì)胞，分別計算增殖細(xì)胞所占百分率和凋亡細(xì)胞指數(shù)A1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，用均值±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠腫瘤大小和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，見表1。

表1 治療組與對照組膀胱腫瘤大?。╩m2）及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（%）比較

上表提示，治療組5只裸鼠中無1只發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而對照組5只中有3只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為60%，在腫瘤大小方面，治療組與對照組相比較也存在明顯差異。兩組在腫瘤大小和轉(zhuǎn)移率方面的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體分別通過下調(diào)癌基因miRNA－21和上調(diào)抑癌基因（Tumstatin）水平來抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，從而有效遏制膀胱癌生長轉(zhuǎn)移。MTT法和TUNEL法檢測結(jié)果分別顯示，治療組的細(xì)胞增殖率是41.30%，與對照組的94.7%相比較，P＜0.05，治療組的細(xì)胞凋亡率指數(shù)為30.18，明顯高于對照組的9.53，兩者比較P＜0.05，比較兩組間細(xì)胞增殖率和凋亡指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖1中細(xì)胞核呈黃褐色者代表增殖細(xì)胞，圖2中細(xì)胞核呈棕黃色者為凋亡細(xì)胞。

圖1 裸鼠移植瘤細(xì)胞增殖分析（MTT）×200

圖2 裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡分析（TUNEL）×200

3 討論

研究證實，腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移是由于癌基因和抑癌基因這一平衡體系被某種鮮為人知的因素所打破，使癌基因激活，抑癌基因失活，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［8］。本研究結(jié)果顯示，治療組腫瘤生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，瘤細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，而凋亡指數(shù)則顯著高于對照組，提示治療后腫瘤細(xì)胞凋亡的增加可能是腫瘤生長緩慢的直接原因，而瘤細(xì)胞凋亡可能是癌基因水平下調(diào)，抑癌基因活性提高的繼發(fā)性改變。

由于反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體具有同時抑制癌基因miRNA－21和上調(diào)抑癌基因Tumstatin的雙重性特異作用，故其遏制裸鼠原位移植膀胱癌生長的作用明顯優(yōu)于單純抗miRNA－21的作用。如果這一實驗結(jié)果能在臨床膀胱癌的治療中得到證實，那么，以雙位點為主導(dǎo)的基因靶向治療可能將為膀胱癌的治療提供一種新的更加確實有效的治療方法。

另外，截止目前，雖然包括淋巴結(jié)清除在內(nèi)的外科手術(shù)加化療仍是膀胱癌的常規(guī)治療模式，但是有些病例診斷后失去了手術(shù)機會，還有相當(dāng)一部分病例手術(shù)后局部復(fù)發(fā)。大多數(shù)膀胱癌雖對化療藥物有一定的敏感性，然而化療本身的毒副作用和在化療過程中出現(xiàn)的耐藥性仍是目前難以克服的治療瓶頸。眾多實驗顯示，膀胱癌的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后均與遺傳基因密切相關(guān)，抑制癌基因表達(dá)或上調(diào)抑癌基因水平能顯著抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移［9，10］。本實驗試用反義 miRNA－21／rAV－Tumstatin病毒載體來遏制膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，初步觀察到治療組腫瘤生長緩慢，且無一只發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，與對照組相比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。由此實驗結(jié)果推測，如果把基因療法與傳統(tǒng)的手術(shù)和化療有效聯(lián)合，這可能比目前手術(shù)加化療的傳統(tǒng)治療模式對膀胱癌病人更有幫助，尤其能大大提高喪失手術(shù)機會的膀胱癌病人的療效。

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