大腸癌組織Runx3基因啟動(dòng)子甲基化的研究

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科（西安710061）

徐 瑞△＃ 劉 偉＊ 李麗娜＃

Runx3基因是近年來在胃癌中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因［1］，據(jù)報(bào)道至少40%的胃癌組織中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，此種高甲基化狀態(tài)直接導(dǎo)致基因靜默，表達(dá)缺失［2］。Runx3基因啟動(dòng)子甲基化具有很高腫瘤特異性，有望成為胃癌診斷的早期標(biāo)記。Runx3基因是否在大腸癌的發(fā)病中起重要作用，目前尚不完全清楚。本研究中我們檢測了大腸癌中Runx3基因的表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與Runx3抑癌基因失活的關(guān)系及其對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響和意義。

材料與方法

1 組織標(biāo)本 收集陜西省腫瘤醫(yī)院2009年8月至2010年12月期間手術(shù)切除的37例大腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本，其中男21例，女16例，年齡35～75歲。病例均經(jīng)過2名病理科醫(yī)生確定診斷。置于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、HCT1116為本院所保存，用含10%小牛血清的Ma COY’s 5 A完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-d C購自Sig ma公司，終濃度為5μM的5-aza-d C處理結(jié)腸癌細(xì)胞系72h，等體積的DMSO處理細(xì)胞作為溶劑對照。

3 DNA和RNA的提取 取備用的大腸癌標(biāo)本約20μg研磨成粉，利用Ta Ka Ra公司的基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書提取組織和細(xì)胞DNA，并測定其純度和濃度備用。

RNA的提取利用天根公司RNA提取試劑盒，按照說明書提取總RNA并測定其純度和濃度，利用Ta Ka Ra公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得c DNA用于PCR模板。

4 Real time PCR 引物序列［3］為：Runx3上游5′CAGAAGCTGGAGGACCAGAC3′，下游5′GTCGGAGAATGGGTTCAGTT3′，擴(kuò)增 產(chǎn)物為180bp；GAPDH 上游 5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3′，下游 5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為138bp。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，利用IQ5進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60s，變性5s，62℃退火延伸30s，40輪循環(huán)，自動(dòng)設(shè)置熔解曲線。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。利用IQ5分析系統(tǒng)分析每個(gè)樣本基因表達(dá)強(qiáng)度，以各自GAPDH表達(dá)值為參考。

5 MSP分析Runx3基因甲基化狀態(tài) 甲基化特異PCR（MSP）：①重硫酸氫鹽修飾：取 DNA約1μg，加入終濃度0.3 mol／L的Na OH中，37℃水浴30 min；3.9mol／L亞硫酸氫鈉（PH5.0）520μl與10mmol／L對苯二酚30μl混合，加入堿變性后的DNA 50μl，覆蓋礦物油，55℃水浴18h。②模板DNA純化：經(jīng)過堿基修飾的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化。0.3mol／L Na OH與純化DNA反應(yīng)去除硫化基團(tuán)，乙酸鈉、乙醇沉淀DNA，去離子水重懸，-20℃保存。③PCR擴(kuò)增：采用Runx3基因特異的甲基化引物和非甲基化引物對修飾后的DNA進(jìn)行擴(kuò)增［4］。PCR反應(yīng)總體積20μl，模板 DNA 2μl，10μmol／L上下游引物各1μl，10 mmol／Ld NTP混合物1μl，熱啟動(dòng) Taq酶1 U。98℃變性45s，63℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10 min。雙蒸水代替DNA進(jìn)行PCR作陰性對照。2%瓊脂糖凝膠中電泳。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 ，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 Runx3基因mRNA水平在大腸癌組織中的表達(dá) 見圖1。Real time PCR檢測37例大腸癌及對應(yīng)癌旁組織中Runx3基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：大腸癌中Runx3基因表達(dá)的平均水平為1.787±0.252，低于癌旁組織中的平均表達(dá)水平（14.33±1.236）。二者具有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 Runx3基因在大腸癌及癌旁組織中mRNA水平的相對表達(dá)水平

2 Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在大腸癌中的檢測 見圖2～3。利用甲基化特異性PCR檢測大腸癌組織中Runx3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況。37例大腸癌組織中11例有甲基化產(chǎn)物，甲基化陽性率為30%，而僅1例癌旁組織檢測到甲基化產(chǎn)物，甲基化陽性率為2.7%，二者比較具有極顯著性差異（P＜0.01）。另外，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和HCT116中檢測Runx3基因甲基化狀況，結(jié)果顯示：HT29呈完全甲基化狀態(tài)；而HCT116細(xì)胞系中該基因呈非甲基化狀態(tài)。

3 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-d C能夠使Runx3基因表達(dá)復(fù)活 見圖4。Runx3基因在正常結(jié)腸黏膜組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中正常表達(dá)，而在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29中均表達(dá)靜默。經(jīng)過去甲基化藥物5-azad C處理上述結(jié)腸癌細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)Runx3基因在HT29細(xì)胞中表達(dá)明顯復(fù)活，而在HCT116中Runx3基因表達(dá)不受影響。

圖2 Runx3基因啟動(dòng)子MSP檢測結(jié)果及測序圖M甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物；u非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物；T大腸癌組織；N癌旁組織

圖3 Runx3基因甲基化水平

圖4 5-aza-d C處理細(xì)胞系后Runx3基因表達(dá)變化

討 論

既往報(bào)道顯示：Runx3基因?yàn)橐职┗?，在胃癌組織中處于失活狀態(tài)。機(jī)制研究顯示其失活機(jī)制為雜合性缺失和啟動(dòng)子高甲基化［5］。因Runx3基因高甲基化具有高度的腫瘤特異性，有望成為胃癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志，故已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。國外已對胃癌、胰腺癌、膽管癌、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等作了研究，均發(fā)現(xiàn)不同程度Runx3基因啟動(dòng)子甲基化，尤其與消化系統(tǒng)組織來源腫瘤密切相關(guān)，但是國內(nèi)沒有在大腸癌中研究Runx3基因甲基化的系統(tǒng)報(bào)道。既往許多研究發(fā)現(xiàn)TGFβ途徑的異常在大腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，故我們推測作為TGFβ途徑關(guān)鍵基因的Runx3也參與大腸癌的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：Runx3基因在大腸癌組織的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中。這種表達(dá)的差異說明Runx3基因在大腸癌中的表達(dá)降低與大腸癌的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)，我們探討這種表達(dá)降低的機(jī)制發(fā)現(xiàn)30%的大腸癌組織中Runx3基因甲基化，甲基化比例與Goel等報(bào)道的比例相似［6］，Runx3基因甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)沉默的原因之一，可能參與了大腸癌的發(fā)生。此結(jié)果與國外學(xué)者在肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌中所發(fā)現(xiàn)的Runx3甲基化存在腫瘤特異性的結(jié)果一致，推測Runx3甲基化有可能成為腫瘤診斷標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)在1例癌旁大腸黏膜組織中檢測到甲基化產(chǎn)物，這可能與患者年齡大有關(guān)。既往日本學(xué)者也曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)Runx3基因甲基化與人類的衰老存在明顯的相關(guān)性。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種重要方式，是一個(gè)可逆的過程。實(shí)驗(yàn)研究中最常用到的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-d C，它通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性達(dá)到去甲基化的作用。為了研究Runx3基因甲基化敏感性，本研究中采用兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HT29細(xì)胞中Runx3呈高度甲基化狀態(tài)，5-aza-d C處理后，Runx3表達(dá)復(fù)活。這說明DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄水平抑制Runx3基因表達(dá)，進(jìn)而減少蛋白的合成。Runx3蛋白下調(diào)可能使TGFβ途徑生長抑制作用減弱，形成腫瘤。

本研究結(jié)果顯示：Runx3基因在大腸癌中的表達(dá)下降，DNA甲基化研究檢測發(fā)現(xiàn)Runx3基因在大腸癌中處于高甲基化狀態(tài)，提示其可能是Runx3基因下調(diào)的機(jī)制之一。由此可見Runx3基因甲基化沉默在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能有一定的作用。至于其在大腸癌的早期診斷、療效檢測和預(yù)后評估中的價(jià)值及其能否作為大腸癌生物學(xué)標(biāo)志仍需進(jìn)一步的證實(shí)。

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