不同環(huán)氧合酶-2抑制劑治療大鼠腦外傷早期炎癥實驗觀察

河北省秦皇島市第一醫(yī)院神經(jīng)外科二病區(qū)（秦皇島066000）

吳 磊 趙建華 馮 繼▲

腦外傷后的炎癥反應(yīng)是腦組織持續(xù)性損傷的重要原因，針對早期炎癥反應(yīng)的及時有效處理，會降低損傷程度，改善預(yù)后。COX-2是一種花生四烯酸代謝的限速酶，其產(chǎn)生的前列腺素和血栓素是腦創(chuàng)傷后患者發(fā)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)之一［1］。近期研究表明：腦外傷早期伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，腦組織中COX-2的表達常異常增高，且這種增高狀態(tài)持續(xù)越久，預(yù)后越不良［2］。有研究表明：COX-2在腦外傷早期可以大量生成，可能是導(dǎo)致患者損傷加劇的重要因素之一，通過抑制COX-2的產(chǎn)生，可以為治療腦創(chuàng)傷早期炎癥反應(yīng)提供新途徑［3］。該研究就兩種COX-2抑制劑，選擇性抑制劑尼美舒利和非選擇性抑制劑吲哚美辛，進行平行比較試驗，并就其可能存在的機制予以淺顯分析。

材料與方法

1 動物與試劑 實驗動物選擇SD雄性大鼠96只，體重250±2g，清潔級，購于中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。尼美舒利由廣東省藥物研究所提供，吲哚美辛購自Gay man公司（英國）；COX-2引物由北京賽百勝公司合成，RT-PCR試劑盒由美國Qiagen公司生產(chǎn)；兔抗大鼠COX-2單克隆抗體由美國Santa公司生產(chǎn)；檢測PGE2含量的ELISA檢測試劑盒由上海太陽生物技術(shù)公司生產(chǎn)；Western-Blot化學(xué)發(fā)光試劑盒由美國Pierce公司生產(chǎn)。

2 動物與分組 將96只大鼠隨機分為對照組（不接受治療）、尼美舒利治療組和吲哚美辛治療組，每組32只。在打擊創(chuàng)傷后對照組的實驗動物仍然不接受任何治療；尼美舒利和吲哚美辛治療組分別按照6 mg／kg和25 mg／kg劑量每12h進行腹腔注射給藥1次。此后分別于實驗第24、48、72和96小時每組動物隨機處死8只，獲取鼠腦組織儲存?zhèn)溆?。動物處死前對每只大鼠行神?jīng)功能缺損綜合評分，評分參照Reglodi等［3］的方法，每個時間點每只大鼠評測3次，每次間隔10 min，取算術(shù)平均值。

3 腦創(chuàng)傷模型的建立 以3.5 ml／kg體重對實驗大鼠進行腹腔麻醉后，充分暴露大鼠的顱骨，控制其以前囟后為2.0 mm、同時以中線右側(cè)2.0 mm為中心，以磨鉆在顱骨磨一直徑4 mm圓形骨窗，使硬膜保持完整，在骨窗邊緣進行固定打擊。將液壓顱腦創(chuàng)傷儀連接，使打擊管內(nèi)部保持密閉，將峰值沖擊壓力控制為1.5～2.0at m、平均時程控制為23 ms沖擊致傷。

4 RT-PCR檢測COX-2 mRNA水平 提取大鼠腦組織的總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶進行轉(zhuǎn)錄后運行PCR循環(huán)反應(yīng)。COX-2的引物序列是，上游5’-CCG CAG TAC AGA AAG TAT CAC-3’，下游 5’-ACA GCC CTT CAC GTT ATT G-3’，產(chǎn)物的大小大約為402bp。反應(yīng)條件控制如下：94℃條件下3 min后連續(xù)運行45個循環(huán)，每個循環(huán)控制在94℃30 s、60℃45s、72℃30s。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分析儀分析結(jié)果。

5 Wester n-Blot檢測COX-2蛋白水平 提取大鼠腦組織的總蛋白，采用Bradford法來測定其蛋白量。電泳后考馬斯亮藍(lán)染色，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，使用Wester n封閉液在37℃下進行2h封閉，在PBS漂洗后滴加1∶500稀釋的COX-2單克隆抗體在4℃下過夜，于第2日加入辣根酶標(biāo)記的1∶500稀釋的二抗控制溫度為37℃保持2h。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，采用Quantity One軟件進行分析。

6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測PGE2含量 將大鼠的每塊組織都放在含有1 ml含70%甲醇的離心管中。使用超聲破膜機將組織徹底勻漿，在冰上放置5 min可以使蛋白充分變性。在離心后棄掉上清液，在干燥機中將其干燥徹底，目的可以充分除去甲醇。使用1 ml的EIA緩沖液來溶解標(biāo)本。操作要嚴(yán)格按照試劑盒說明使用EI ISA法檢測PGE2含量。

7 統(tǒng)計學(xué)處理 本組應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 RT-PCR結(jié)果 見圖1。對照組的腦組織在大鼠傷后24 h COX-2 mRNA的水平明顯增高，至第3天達峰值，此后稍有下降；尼美舒利和吲哚美辛治療組與對照組同期比較，COX-2 mRNA水平明顯降低（P＜0.05），尼美舒利治療組COX-2 mRNA水平比吲哚美辛治療組更低，二者間有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 RT-PCR實驗顯示COX-2 mRNA的表達

2 Wester n-Blot結(jié)果 見圖2。與COX-2 mRNA表達趨勢保持一致，在大鼠腦創(chuàng)傷后COX-2的蛋白表達水平呈現(xiàn)出了明顯改變。尼美舒利和吲哚美辛治療組COX-2蛋白水平明顯低于對照組（P＜0.05），尼美舒利治療組COX-2蛋白水平比吲哚美辛治療組更低（P＜0.05）。

3 PGE2含量測定結(jié)果 見圖3。尼美舒利和吲哚美辛治療組與對照組同期比較，PGE2含量明顯降低（P＜0.05），尼美舒利治療組PGE2水平同吲哚美辛治療組比較，二者間無顯著性差異（P＞0.05）。

4 神經(jīng)功能評分 見附表。與對照組同期比較，尼美舒利和吲哚美辛治療組實驗大鼠神經(jīng)功能評分明顯優(yōu)于對照組（P＜0.05）。兩治療組間大鼠神經(jīng)功能評分比較無顯著性差異（P＞0.05）。

附表 兩種COX-2抑制劑治療后腦神經(jīng)功能評分比較（±s，分）

附表 兩種COX-2抑制劑治療后腦神經(jīng)功能評分比較（±s，分）

注：﹡與對照組比較，P＜0.05；△與尼美舒利比較，P＞0.05

對照組 34.19±2.37 18.91±1.83 17.13±1.71 16.04±1.47 15.09±1.91尼美舒利 35.27±2.46 16.32±2.03＊ 14.67±1.56＊ 12.75±1.52＊ 11.69±1.43＊吲哚美辛 36.09±2.97 17.28±2.08＊△ 16.07±2.05＊△ 12.11±1.32＊△ 10.99±1.06＊△

圖2 Wester n-Blot實驗顯示COX-2蛋白水平的表達

圖3 ELISA實驗顯示PGE2水平的表達

討 論

COX-2是一種重要的炎癥介質(zhì)，在前列腺素的合成過程中起到了重要作用，是一種限速酶，其可將花生四烯酸有效轉(zhuǎn)化為血管活性的前列腺素前體物質(zhì)，使氧自由基明顯增多，從而使得脂質(zhì)過氧化，DNA損傷和細(xì)胞膜破壞加劇，減弱了血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管舒張反應(yīng)性，造成了細(xì)胞損傷、代謝紊亂和血管機能障礙［4］。

COX-2在正常生理情況下含量極低，腦組織的COX-2主要存在于神經(jīng)細(xì)胞膜［5］。COX-2本身并沒有強效的致神經(jīng)損傷作用，但與COX-2活性密切相關(guān)的促炎性花生四烯酸產(chǎn)物是導(dǎo)致腦損傷持續(xù)性加重的主要原因之一。COX-2的酶解產(chǎn)物可以在至少3個環(huán)節(jié)上加重其腦損傷：脈管系統(tǒng)、血腦屏障和神經(jīng)元本身［6］。血管收縮因子也是一種前列腺素，血栓素A 2（TXA2）是當(dāng)前我國已知的一種血管收縮因子。前列腺素和多種白三烯可以促進其血腦屏障完全開放。選擇性COX-2可以作為一種抑制劑，使得尼美舒利能劑量依賴性地減少，同時還可以大幅減少腦缺血再灌注后的梗死體積，改善腦缺血后的神經(jīng)缺陷，促進功能恢復(fù)，是腦缺血性損傷治療的有效藥物［7］。非選擇性COX-2抑制劑吲哚美辛是非甾體抗炎藥物的代表，在臨床和基礎(chǔ)研究中都被廣泛應(yīng)用。但到目前為止，有關(guān)尼美舒利在腦外傷早期降低炎癥反應(yīng)及其與非甾體抗炎藥物的療效比較，藥物作用機制等均未明確。

本研究利用大鼠腦損傷模型，對選擇性COX-2抑制劑尼美舒利和非選擇性COX-2抑制劑吲哚美辛在降低腦外傷早期炎癥反應(yīng)程度方面進行比較研究。我們的結(jié)果顯示，尼美舒利在降低COX-2 mRNA水平和抑制COX-2蛋白質(zhì)合成方面強于吲哚美辛，但在降低PGE2水平以及改善神經(jīng)功能方面二者之間無顯著性差異。這一結(jié)果提示：選擇性COX-2抑制劑尼美舒利通過直接對COX-2 mRNA水平和（或）蛋白質(zhì)合成的抑制作用，降低PGE2水平，進而抑制炎癥反應(yīng)，降低損傷程度，提高神經(jīng)功能評分；與此相對應(yīng)，吲哚美辛降低COX-2 mRNA水平和（或）蛋白質(zhì)合成方面明顯低于尼美舒利，但其降低PGE2水平和改善神經(jīng)功能方面與前者比較無顯著性差異，提示吲哚美辛抑制腦外傷早期炎癥反應(yīng)可能存在其它通路。

［1］Harris RE.Cyclooxygenase-2（cox-2）and the inflammogenesis of cancer［J］.Subcell Biochem，2007，42（1）：93-126.

［2］Strauss KI，Bar be MF，Marshall RM，etal.Pr olonged cyclooxygenase-2 induction in neurons and glia following trau matic brain injury in the rat［J］.J Neurotrau ma，2000，17（8）：695-711.

［3］Reglodi D，Tamas A，Lengvari I.Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res Bull，2003，59（2）：459-466.

［4］張 堅，徐卓群，胡 強，等.選擇性環(huán)氧合酶2抑制劑對人膀胱癌細(xì)胞T24增殖和凋亡的作用［J］.癌癥，2007，26（4）：377-381.

［5］Terracciano S，Aquino M，Rodriquez M，etal.Chemistry and biology of anti-inflammatory marine natural products：molecules interfering with cyclooxygenase，NF-kappaB and other unidentified tar gets［J］.Curr Med Chem，2006，13（16）：1947-1969.

［6］郭建友，楊元宵，趙寶勝，等.桂皮醇對IL-1刺激腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞COX活性及PGE2釋放的影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（8）：596-599.

［7］鄭 剛，張 進.COX-2抑制劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用研究［J］.福建醫(yī)藥雜志，2006，28（2）：103-105.