超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中硝苯地平的濃度

尤曉明，董吉，沈國榮（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中硝苯地平的濃度

尤曉明＊，董吉，沈國榮#（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006）

目的：建立測定人血漿中硝苯地平濃度的方法。方法：采用液-液萃取法處理血漿后以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)樣測定。色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18，流動相為甲醇-10mmol·mL－1甲酸銨水溶液（85∶15），流速為0.2mL·min－1，正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描分析，離子通道分別為m/z 347.14→315.15（硝苯地平）、m/z 384.10→338.10（非洛地平）。結(jié)果：硝苯地平血藥濃度在1～200ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.9980），定量下限為1ng·mL－1，提取回收率為68.2%～71.2%，方法回收率為94.0%～106.5%，日內(nèi)、日間RSD均＜11%。結(jié)論：本方法操作簡便、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于硝苯地平的藥動學(xué)研究。

硝苯地平；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；藥動學(xué)；血藥濃度

硝苯地平為二氫吡啶類鈣拮抗藥，是繼腎上腺素β受體阻滯藥之后國際上公認(rèn)的重要心血管系統(tǒng)藥。2007年發(fā)表的國內(nèi)心血管系統(tǒng)藥物利用調(diào)查中，硝苯地平為臨床選擇頻率最高品種之一[1]。文獻(xiàn)報道了血漿中硝苯地平的高效液相色譜（HPLC）-紫外檢測法[2]，近年來也有應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法進(jìn)行硝苯地平藥動學(xué)研究的文獻(xiàn)報道[3]，但有關(guān)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法進(jìn)行硝苯地平體內(nèi)濃度測定及藥動學(xué)研究的報道較少。本文旨在建立一種簡便、靈敏、準(zhǔn)確地測定血漿中硝苯地平濃度的方法，滿足硝苯地平藥動學(xué)研究的需要。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Quattro Premier三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Millipore Synergy?UV超純水機(jī)（美國Millipore公司）；5804R高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；XS105DU電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

硝苯地平對照品（常州四藥制藥有限公司，含量：99.4%，批號：20100409）；內(nèi)標(biāo)：非洛地平對照品（浙江蘇泊爾藥業(yè)有限公司，含量：99.5%，批號：30557-200501）；硝苯地平緩釋膠囊（哈藥集團(tuán)制藥總廠，規(guī)格：每粒20mg，批號：A091000206，有效期：24個月）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：甲醇-10mmol·mL－1甲酸銨水溶液（85∶15），等度洗脫；流速：0.2mL·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：7.5μL。

電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；毛細(xì)管電壓：1.5kV；錐孔電壓：12V；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流速：650L·h－1；錐孔氣流速：50L·h－1。硝苯地平和非洛地平的離子通道分別為m/z 347.14→315.15和m/z 384.10→338.10。

2.2 受試者選擇與試驗設(shè)計

20名中國男性健康受試者，年齡（23.0±1.9）歲，身高（171±8）cm，體重（58±8）kg。試驗前經(jīng)病史詢問，體檢，胸部透視，心電圖、血尿常規(guī)、血生化檢查，各項指標(biāo)均正常；受試者無藥物過敏史和藥物依賴史，無精神病史及其他慢性病史；受試前2周及試驗期間未服用任何其他藥物；受試期間禁煙、酒及其他含咖啡因、茶堿等的飲料，避免劇烈運(yùn)動；研究前簽署知情同意書，并經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。試驗前禁食10h，于次日7：00時空腹服用硝苯地平緩釋膠囊（20mg），服藥后4h禁食。受試者于給藥前和給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、24.0、36.0h時，由肘正中靜脈取血3mL，并立即移入抗凝管中離心（3500×g）10min，分離血漿，于－70℃保存待測。

2.3 血漿樣品處理

精密吸取人血漿樣品200μL，加內(nèi)標(biāo)溶液（500ng·mL－1非洛地平）30μL，渦旋振蕩30s，加入乙醚1.2mL，渦旋振蕩1min，11895×g離心5min，取上層液1.0mL至離心管，氮?dú)獯蹈桑恿鲃酉?20μL復(fù)溶，渦旋振蕩4min，20817×g離心5min，取上清液90μL移至進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣7.5μL分析。全部分析測定操作均在避光下進(jìn)行。

2.4 數(shù)據(jù)處理

藥動學(xué)分析采用非房室模型，以梯形法計算AUC0～t，由消除相末端濃度點(diǎn)計算t1/2和Ke，以末端點(diǎn)濃度和Ke的比值計算AUC0～∞，達(dá)峰濃度（cmax）和達(dá)峰時間（tmax）為實(shí)測值。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)譜分析

硝苯地平和非洛地平在ESI離子化方式下，主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，分別為m/z 347.14和m/z 384.10。選擇上述離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，硝苯地平和非洛地平的主要碎片離子分別為m/z 315.15和m/z 338.10，并將其作為定量分析時檢測的產(chǎn)物離子。典型的碎片離子圖見圖1。

圖1 碎片離子圖A.硝苯地平；B.非洛地平Fig 1Ion map of fragmentA.nifedipine；B.felodipine

3.2 方法特異性

在血漿測定條件下，硝苯地平和非洛地平的保留時間分別為1.46min和2.08min，見圖2。6種不同來源的血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)，不干擾藥物和內(nèi)標(biāo)測定，可見方法具有良好的特異性和分離度。

圖2 硝苯地平和內(nèi)標(biāo)非洛地平的典型多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+10ng·mL－1硝苯地平+內(nèi)標(biāo)；C.志愿者服用硝苯地平緩釋膠囊20mg 2h后的血樣Fig 2Typical MRM chromatograms of nifedipine and internal standard felodipineA.blank plasma；B.blank plasma+10ng·mL－1nifedipine+internal standard；C.blood sample of volunteers 2h after oral administration of Nifedipine sustained-release capsules 20mg

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及定量下限考察

在空白血漿中分別加入不同量的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200ng·mL－1的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本。按“2.3”項下方法操作后進(jìn)樣測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度為X軸，樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為Y軸，進(jìn)行線性回歸計算，經(jīng)“1/X2”權(quán)重得回歸方程為：Y＝0.02384X+0.00117（r＝0.9980），結(jié)果表明，硝苯地平血藥濃度在1～200ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取空白血漿，加入硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制最低定量點(diǎn)血漿樣本200μL各6份（濃度為1ng·mL－1），處理后測定，結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果分別為5.3%和104.0%，表明測定血漿中硝苯地平的定量下限可達(dá)1ng·mL－1。

3.4 精密度及回收率試驗

取空白血漿，加入不同量的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制低、中、高（2、20、150ng·mL－1）3種濃度血漿樣本200μL各6份 ，連續(xù)測定3批，求得回收率及日內(nèi)、日間RSD，見表1。

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果Tab 1Results of precision and recovery test

3.5 提取回收率試驗

測定低、中、高（2、20、150ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血漿樣本各6份，得到峰面積A1；同時取空白血漿按“2.3”項下方法處理后，加入適量硝苯地平和內(nèi)標(biāo)工作溶液，配制成與血漿質(zhì)控樣本理論進(jìn)樣溶液相同濃度的溶液進(jìn)樣分析，得峰面積A2。以A1/A2的比值求算硝苯地平的提取回收率，詳見表1。

3.6 基質(zhì)效應(yīng)

取6種不同來源的空白血漿，提取后，每種空白基質(zhì)制備低、中、高（2、20、150ng·mL－1）3種進(jìn)樣濃度的樣本，將其峰面積與進(jìn)樣溶劑中添加相同量的硝苯地平和內(nèi)標(biāo)工作溶液的峰面積進(jìn)行比較，求算硝苯地平和內(nèi)標(biāo)非洛地平的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)因子（MF）＝（空白基質(zhì)中添加化學(xué)品峰面積/進(jìn)樣溶劑中添加化學(xué)品峰面積）×100%。如MF＞100%則為離子增強(qiáng)，MF＜100%則為離子抑制。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)控樣本中硝苯地平的MF為96.1%、98.6%、95.5%，非洛地平的MF為90.4%，結(jié)果見表2。

表2 血漿中硝苯地平的基質(zhì)因子Tab 2MF of nifedipine

3.7 穩(wěn)定性試驗

考察處理后硝苯地平血漿樣本在自動進(jìn)樣器（8℃）放置24h，血漿樣本室溫避光放置8h、3次凍融以及－70℃凍存66d的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，經(jīng)處理的血漿樣本在自動進(jìn)樣器中（8℃）放置24h，血漿樣本室溫避光放置8h、經(jīng)過3次凍融、－70℃凍存66d仍能保持穩(wěn)定。

3.8 在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用

20名健康受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后藥動學(xué)參數(shù)見表3；20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg平均藥-時曲線見圖3。

4 討論

相比HPLC法，采用柱填充顆粒1.7μm的UPLC方法具有更高的分辨率、更快的分析速度、更好的選擇性和特異性。本試驗采用UPLC技術(shù)，大大提高了分離度，僅需3min就達(dá)到了分析的目的，減少了有機(jī)溶劑的消耗。

由于硝苯地平遇光不穩(wěn)定，所以操作均在避光條件下進(jìn)行。曾試用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等有機(jī)溶劑進(jìn)行液-液萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醚提取吹干迅速，可縮短前處理的時間，減少樣品的降解，故選作萃取劑。

基質(zhì)效應(yīng)是影響基于質(zhì)譜的生物分析方法的因素之一?；|(zhì)效應(yīng)的定量檢測可以用MF來表示，它定義為當(dāng)基質(zhì)離子存在時待測物峰響應(yīng)值與基質(zhì)離子不存在時待測物峰響應(yīng)值的比值。MF＝1表明基質(zhì)效應(yīng)不存在；MF＜1表明存在離子抑制；MF＞1表明可能存在離子增強(qiáng)。一個可靠的生物分析方法并不要求絕對MF接近1，但是，如果單個受試者的MF之間差異大則會造成分析重現(xiàn)性較低。為了檢驗來自單個受試者的樣品MF差異，本試驗中測定了來自6個受試者基質(zhì)的MF。MF的差異性由相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來衡量，RSD＜15%，則可滿足美國FDA生物分析方法的要求[4]。

筆者建立了測定人血漿中硝苯地平濃度的UPLC-MS/MS法，定量下限為1ng·mL－1；低、中、高3種濃度的日間和日內(nèi)RSD＜11%；采用液-液萃取法進(jìn)行樣品處理，簡單易行。結(jié)果表明本法準(zhǔn)確、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，適用于硝苯地平緩釋膠囊的藥動學(xué)研究。

表3 20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in 20healthy volunteers after oral administration of nifedipine sustained-release capsules 20m（g

表3 20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后的藥動學(xué)參數(shù)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in 20healthy volunteers after oral administration of nifedipine sustained-release capsules 20m（g

藥動學(xué)參數(shù)cmax/n g·mL-1 tmax/h t1/2/h A U C0～36h/n g·h·mL-1 A U C0～∞/n g·h·mL-1數(shù)值52.7±31.23.0±1.45.4±2.6363.8±177.5377.4±179.0

圖3 20名受試者口服硝苯地平緩釋膠囊20mg后的平均藥-時曲線Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of nifedipine in 20healthy volunteers after oral administration of nifedipine sustained-release capsules 20mg

[1] 馮 琳，侯孝云，孟 玲，等.2005年長江流域157家醫(yī)院心血管系統(tǒng)藥物利用分析的應(yīng)用[J].中國新藥與臨床雜志，2007，26（3）：175.

[2] Zendelovska D，Simeska S，Sibinovska O，et al.Development of an HPLC method for the determination of nifedipine in human plasma by solid-phase extraction[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，839（1-2）：85.

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Determination of Nifedipine Concentration in Human Plasma by UPLC-tandem Mass Spectrometry

YOU Xiao-ming，DONG Ji，SHEN Guo-rong（The First Affiliated Hospital of Soochow University，Jiangsu Suzhou 215006，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of nifedipine concentration in human plasma.METHODS：The plasma procedure involved a single-step liquid-liquid extraction，then chromatographed on a Waters Acquity UPLC BEH C18column with mobile phase consisted of methanol-10mmol·mL－1ammonium formate（85∶15）at the flow rate of 0.2mL·min－1.The protonated ions of analytes were detected in positive ionization in multiple reaction monitoring mode（MRM）.The mass transition pairs of m/z 347.14→315.15and m/z 384.10→338.10were used to detect nifedipine and felodipine.RESULTS：The linear range of nifedipine was 1～200ng·mL－1（r＝0.9980）and the lowest limit of quantitation was 1ng·mL－1.The extraction recovery rates were ranged from 68.2%to 71.2%，and method recoveries were 94.0%～106.5%.RSDs of intra-day and inter-day were all less than 11%.CONCLUSION：The method is simple，quick，specific and sensitive，and suitable for the pharmacokinetics research of nifedipine.

Nifedipine；UPLC-tandem mass spectrometry；Pharmacokinetics；Plasma concentration

R969.1

A

1001-0408（2012）46-4355-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.46.13

2012-10-09

2012-10-30）