加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬NMDA-NR1mRNA／蛋白表達(dá)的影響1）

張 曼，張麗萍，武 麗，顧志敏

抑郁癥是一種常見的心境障礙綜合征，煩躁、緊張不安的精神狀態(tài)，以及憂郁、悲傷的情感狀態(tài)是其主要臨床表現(xiàn)［1］。研究表明，孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型能較好模擬抑郁癥精神及情感狀態(tài)［2］，被認(rèn)為是目前與人類抑郁狀態(tài)最為吻合的模型，已廣泛應(yīng)用于抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁藥物的藥理學(xué)研究［3，4］。

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體阻斷劑及其相關(guān)藥物已被證實(shí)具有抗抑郁作用［5］。研究表明，應(yīng)激使大鼠海馬NMDA受體（NMDA-NR1）過(guò)度激活從而造成興奮性神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，從而引發(fā)抑郁癥［6-8］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過(guò)終期效應(yīng)觀察證實(shí)，加味溫膽湯具有較好的抗抑郁功效，其機(jī)制與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)［9］。加味溫膽湯的抗抑郁機(jī)制可能與抑制NMDA受體，阻抑神經(jīng)元凋亡有關(guān)。本研究以孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激抑郁模型為研究對(duì)象，在抑郁形成的不同階段動(dòng)態(tài)研究加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬NMDA-NR1mRNA／蛋白表達(dá)的阻抑作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8周齡SD雄性大鼠128只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004，體質(zhì)量180g±20g，清潔級(jí)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。按照隨機(jī)數(shù)字表分組法，將大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、中藥組、西藥組，每組32只。中藥組予加味溫膽湯12g／（kg·d）灌胃，西藥組予氟西汀1.8mg／（kg·d）灌胃，模型組、空白組予生理鹽水2mL／（kg·d）灌胃，每日08：00開始，持續(xù)28d。各組在實(shí)驗(yàn)1d即開始行相應(yīng)干預(yù)方法處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 RNA prep pure動(dòng)物組織RNA提取試劑盒（離心柱型），天根生化科技（北京）有限公司；Prime Script TMRT Reangent Kit（Perfect Real Time）TaKaRa；SYBR RPremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）TaKaRa；Western及IP細(xì)胞裂解液，碧云天公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；一抗兔抗人NMDA-NR1蛋白多克隆抗體，Saierbio公司；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，中杉金橋生物有限公司；轉(zhuǎn)印用PVDF膜，美國(guó)Bio-rad公司。

1.3 孤養(yǎng)結(jié)合慢性應(yīng)激抑郁模型［10］大鼠均單籠飼養(yǎng)，采用24h禁食，通宵照明，4℃冷水游泳5min，45℃烘箱熱烘5 min，夾尾1min，高速水平振蕩3min，100伏電擊足底1min，懸尾1min，共9種刺激方法，隨機(jī)安排到21d內(nèi)，每日一種，每種刺激至少出現(xiàn)2次，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 在實(shí)驗(yàn)7d，14d，21d，28d從每組中隨機(jī)選擇8只大鼠，行曠場(chǎng)行為檢測(cè)，然后斷頭取腦，分別進(jìn)行QRT-PCR檢測(cè)機(jī)Western Blot檢測(cè)。

1.4.1 曠場(chǎng)行為（open-field） 以動(dòng)物穿越曠場(chǎng)試驗(yàn)箱底面方塊數(shù)為水平活動(dòng)得分（四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)分）；以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分（兩前爪騰空或攀附墻壁方可計(jì)分）。分別在7d，14d，21d，28d測(cè)定，每次3min。

1.4.2 QRT-PCR檢測(cè) 設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增的cDNA的引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列分別為：CREB1-f：5’-GCC TCT GGT GAT GTA CAA ACA TAC C-3’；CREB1-r：5’-GGG AGG ACG CCA TAA CAA CTC-3’，引物片段長(zhǎng)度82bp；為準(zhǔn)確檢測(cè)表達(dá)水平，同時(shí)選用內(nèi)參引物：beta-actin-f：5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’；beta-actin-r：5’-CGA TAG TGA TGA CCT GAC CGT-3’，引物片段長(zhǎng)度為137bp。

提取海馬組織總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD26O／OD280比值。

進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4.3 Western-Blot檢測(cè) 按照試劑盒要求提取海馬組織，根據(jù)樣品OD值調(diào)整蛋白濃度。NMDA-NR1蛋白相對(duì)表達(dá)量以相應(yīng)蛋白／beta-actin灰度值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié) 果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)描述 在實(shí)驗(yàn)24d時(shí)，中藥組1只大鼠因灌胃損傷死亡，此鼠數(shù)據(jù)不納入統(tǒng)計(jì)。共127只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 open-field檢測(cè) 在抑郁形成過(guò)程中，模型組open-field實(shí)驗(yàn)水平、垂直運(yùn)動(dòng)得分均呈上升趨勢(shì)，21d、28d時(shí)，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)治療后，抑郁大鼠水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分得到上調(diào)，21d、28d時(shí)中、西藥組水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠在抑郁形成不同時(shí)間段水平運(yùn)動(dòng)得分比較（x±s） 分

表2 各組大鼠在抑郁形成不同時(shí)間段垂直運(yùn)動(dòng)得分比較（x±s） 分

2.3 海馬NMDA-NR1mRNA表達(dá)檢測(cè) 21d時(shí)與空白組比較，模型組大鼠海馬NMDA-NR1mRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，中、西藥組NMDA-NR1mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）。28d時(shí)與空白組比較，模型組NMDA-NR1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，中、西藥組NMDANR1mRNA減少（P＜0.05）。詳見表3。

表3 不同時(shí)間段各組大鼠NMDA-NR1mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s） %

2.4 海馬NMDA-NR1蛋白表達(dá)檢測(cè) 21d時(shí)與空白組比較，模型組NMDA-NR1蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，中、西藥組NMDA-NR1蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。28d時(shí)與空白組比較，模型組NMDA-NR1蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，中、西藥組NMDA-NR1蛋白減少（P＜0.01）。詳表4。

表4 各組大鼠在抑郁不同時(shí)間段NMDA-NR1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x±s） %

3 討 論

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的水平運(yùn)動(dòng)得分反映動(dòng)物活動(dòng)度情況，垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分反映動(dòng)物對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度，抑郁模型大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分及垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分均低于正常大鼠［11］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，抑郁模型大鼠在實(shí)驗(yàn)21d、28d出現(xiàn)以上相似變化，加味溫膽湯對(duì)此變化具有拮抗作用，21d，28d時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。由此推斷，加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠具有較好抗抑郁效應(yīng)，21d時(shí)顯效，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，28d時(shí)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。

在抑郁癥發(fā)病機(jī)制及抗抑郁治療中，NMDA受體的作用已受到關(guān)注。目前已知，NMDA受體廣泛存在于中樞、海馬、紋狀體等部位，具有調(diào)節(jié)Ca2＋門控通道，引起細(xì)胞毒性作用。在應(yīng)激刺激時(shí)，谷氨酸（Glu）所產(chǎn)生的遲發(fā)性損傷主要由NMDA受體介導(dǎo)，Glu不斷增加，過(guò)度激活的NMDA受體，使配體門控性Ca2＋通道病理性開放，引起大量胞外Ca2＋內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載。胞外鈣大量?jī)?nèi)流引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載是細(xì)胞死亡的重要原因，是多種因素引起神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)損害直至死亡的“最后共同通路”。胞漿內(nèi)游離鈣濃度升高的直接后果是激活在正常條件下受鈣調(diào)控的各種酶系統(tǒng)，包括蛋白酶、氧化酶系、蛋白激酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶等，其結(jié)果不但進(jìn)一步加重生物膜的損害及能量危機(jī)，而且與自由基的產(chǎn)生及其損傷作用密切相關(guān)。越來(lái)越多的臨床研究證實(shí)，NMDA-NR1在抑郁癥的病理生理機(jī)制及抗抑郁藥治療中起著重要作用，臨床中發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦中NMDA-NR1表達(dá)升高［12］。在抑郁動(dòng)物模型中，NMDA-NR1拮抗劑已被證實(shí)具有抗抑郁作用［13，14］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組NMDA-NR1mRNA及蛋白表達(dá)在抑郁形成過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，21d時(shí)模型組NMDA-NR1mRNA及蛋白表達(dá)高于空白組（P＜0.01），28d時(shí)差異增大（P＜0.01）。由于在生物體內(nèi)NMDA-NR1興奮性由其數(shù)量及活性所決定，從而提示抑郁模型大鼠海馬NMDA-NR1處于興奮狀態(tài)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，加味溫膽湯的抗抑郁效應(yīng)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，至28d時(shí)明顯增強(qiáng)。加味溫膽湯可能通過(guò)阻抑NMDA-NR1興奮性發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)。結(jié)合前期加味溫膽湯對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡阻抑作用的研究結(jié)果［9］，認(rèn)為加味溫膽湯抗抑郁效應(yīng)的藥理機(jī)制可能與阻抑海馬NMDA-NR1興奮性，減少神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

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