北五味子多糖提取條件及其抗氧化性能

游玟娟，溫擁軍

(湖南化工職業(yè)技術學院，湖南株洲，412004)

五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)為木蘭科植物五味子干燥成熟果實，可分為北五味子和南五味子2種。五味子中含有揮發(fā)油、有機酸、維生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多種化學成分［1］。研究表明［2－5］，五味子多糖具有促進免疫、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老等多種藥理作用和功效。

超聲波技術主要利用超聲產生的“空化”效應，使細胞破裂，具有穿透力強，成本低，操作簡便等特點［6］，因此近年來在天然產物成分提取領域被廣泛應用。本文采用響應曲面法優(yōu)化超聲輔助乙醇提取北五味子多糖工藝條件，并對北五味子多糖抗氧化性能進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

北五味子，購于株洲市千金大藥房。

葡萄糖，3，5-二硝基水楊酸，鎢酸鈉，酒石酸鉀鈉，NaOH，結晶酚，亞硫酸鈉，乙醚，乙酸，石油醚，三氯甲烷等，均為分析純

HH.SYH-Ni2-C水浴鍋(北京長源實驗設備廠)，DHG－9140A型干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);LDZ4－0.8A離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，UV－9100紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)，SB－5200超聲波清洗器(上海新芝生物技術研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 北五味子干粉的制備

將北五味子洗凈后，置于80℃烘箱中烘干后粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2 北五味子多糖測定方法

相應的特征方程為根為r1=0.92，r2,3=-0.21±0.30i,由引理3,原差分方程的解即所求概率為

采用DNS法［7］進行測定。取1g北五味子干粉，按1∶25加入體積分數(shù)70%乙醇，置于功率設定為200 W的超聲波清洗器中，在溫度為60℃條件下提取40 min，小心倒出上清液，重新添加70%乙醇，重復提取5次，收集所有提取液，置于4 000 r/min離心機中離心10 min，取上清液適當稀釋，按DNS法測540 nm處吸光值(A)。以吸光值對應的多糖量乘以稀釋倍數(shù)，除以樣品的質量，即得到北五味子總多糖。各實驗條件下提取的多糖量按如下公式計算:

多糖量/(mg·g－1)(以葡萄糖計)=(c× D ×V/m)×0.9

式中:c為被測液A值所對應標準曲線中葡萄糖濃度(mg/mL);D為稀釋倍數(shù);V為樣品液總體積(mL);m為投加的五味子干粉質量(g)。

1.2.3 北五味子多糖提取條件優(yōu)化方法

單因素實驗提取劑選用乙醇、乙酸、石油醚、氯仿、水5個水平;乙醇體積分數(shù)采用 30%、40%、50%、60%、70%5 個水平;提取溫度為 40、50、60、70、80℃5 個水平;提取料液比(g∶mL)采用 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 五個水平;提取時間采用 30、40、50、60、70 min 5個水平。在單因素實驗基礎上，選擇對提取率影響顯著的3個因素，運用Box-Behnken實驗設計進行3因素3水平響應面優(yōu)化。

1.2.4 北五味子多糖抗氧化性能測定方法

分別測定北五味子多糖提取液對·OH、O－2·清除效果，評價其抗氧化性能。·OH自由基清除率采用賈之慎［7］等Fenton體系比色法進行測定·清除率采用宋慧［8］等實驗方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線繪制及總多糖含量測定結果

以葡萄糖濃度為為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線見圖1，回歸方程為:y=0.403 9x－0.006 4，R2=0.998 8，式中 x為葡萄糖濃度(mg/mL)，y為吸光值。在0～1.2 mg/mL內葡萄糖含量與吸光值呈良好線性關系。測得北五味子中總多糖含量為153.2 mg/g。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取劑對北五味子多糖提取率的影響

取1 g北五味子干粉5份，分別按1∶20(g∶mL)加入50%乙醇、30%乙酸、石油醚、三氯甲烷、水，在超聲波功率為200 W，溫度為60℃條件下提取40 min，提取2次，合并提取液。提取液于4 000 r/min離心機中離心15 min，取1 mL上清液加入提取劑9 mL，混勻，再以提取劑為空白，按DNS法測540 nm處的吸光值。吸光值對應葡萄糖含量乘以稀釋倍數(shù)，除以北五味子干粉的質量，再除以總多糖，得到相對提取率。測得結果見圖2。

圖2 不同提取劑對北五味子多糖提取的影響

由圖2可知，用乙醇和水為提取劑的提取率較高，其中乙醇的相對提取率78.3%，且由于乙醇沸點低，便于后續(xù)濃縮分離工藝，宜選乙醇作為提取劑。

2.2.2 乙醇濃度對北五味子多糖提取率的影響

分別采用30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，按2.2.1方法提取，測相對提取率，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對北五味子多糖提取的影響

圖3結果顯示，30%～70%的乙醇對北五味子多糖的提取能力是先增大后減小。乙醇體積分數(shù)為60%時的相對提取率達到82.2%，繼續(xù)增大濃度則提取效果反而下降，原因是乙醇濃度過高會使細胞膜發(fā)生變性，阻止后續(xù)乙醇分子進入細胞;而且乙醇濃度過高，會影響多糖的溶解度，導致在離心過程中，多糖成分隨殘渣被分離掉，從而影響提取效果。故乙醇溶液宜選60%。

2.2.3 料液比對北五味子多糖提取率的影響

固定超聲波功率為 200 W，分別以 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g∶mL)的料液比加入濃度為 60%的乙醇，在60℃下提取40 min，所得結果見圖4。料液比與提取率成反比，當料液比為1∶25時，多糖相對提取率達到86.4%，再降低料液比提取率增加不顯著。而低料液比會造成乙醇浪費和后續(xù)濃縮的困難。故料液比宜選適1∶25。

圖4 料液比對北五味子多糖提取的影響

2.2.4 提取溫度對北五味子多糖提取率的影響

固定超聲波功率為200 W，料液比為1∶25，溫度分別設為 40、50、60、70、80℃，提取 40 min，所得結果見圖5。結果表明適宜的溫度能夠得到較高的提取率，溫度過高會增加能耗并造成溶劑因蒸發(fā)而損失，使提取率下降。因此，提取溫度宜選60℃。

圖5 溫度對北五味子多糖提取的影響

2.2.5 提取時間對北五味子多糖提取率的影響

固定超聲波功率為200 W，料液比為1∶25，溫度為60℃，提取時間分別設為 30、40、50、60、70 min 進行提取，所得結果見圖6。結果表明，提取時間越長，則相對提取率越高，一般認為，提取率在90%左右時，在經濟上較為合適［9］。因此，提取時間選擇為40 min。

圖6 時間對北五味子多糖提取的影響

2.3 BBD實驗設計及結果

通過單因素實驗，確定了對北五味子多糖提取率影響顯著的3個因素，即提取劑濃度(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)。運用Box-Behnken實驗設計對提取條件進一步優(yōu)化，利用Minitab軟件設計一個3因素3水平共15個試驗點的試驗設計，所得結果如表1所示。

以北五味子多糖相對提取率為響應值，用Minitab15.0軟件對表1所得數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，X2、以及交互項對響應值影響顯著，X、1對響應值影響不顯著，得到X對響應值Y的影響可用回歸方程為:北五味子多糖提取率Y=86.63－2.54 X2－3.03 X3－5.03－7.60－2.43 X1X2+6.35 X2X3，決定系數(shù)R2為97.68%。方差分析結果表明，模型在α=0.01水平上回歸顯著，失擬不顯著，因此模型選擇正確，可用該方程代替真實試驗點對提取率進行分析和預測。求解得到最佳條件為:X1=－0.53，X2=0，X3=－0.2，換算得到各因素的實際水平分別為∶乙醇濃度X1=54.7%、料液比X2=1∶25=58℃，模型預測結果為86.93%，驗證實驗五味子多糖相對提取率為87.12%(n=3)。根據(jù)回歸方程繪制的響應面和等高線分析圖見圖7～圖9。響應面可以直接反應各因子對響應值影響的大小，由等高線圖可得到最優(yōu)條件下各因子的取值［10］。

表1 Box-Behnken實驗設計及結果

圖7 Y=f(X1，X2)響應面立體分析圖和相應等高圖

圖8 Y=f(X2，X3)響應面立體分析圖和相應等高圖

圖9 Y=f(X1，X3)響應面立體分析圖和相應等高圖

圖7顯示，乙醇濃度與料液比交互作用顯著而且復雜，在高料液比、高乙醇濃度的較小區(qū)域內，可得到較高的提取率;固定提取溫度為60℃時，當乙醇體積分數(shù)為68.2%時，料液比為1∶23.3時，相對提取率可達89.00%。圖8顯示，固定乙醇體積分數(shù)60%時，料液比與提取溫度的關系，當提取溫度為57.1℃，料液比為1∶23時，提取率可達87.81%。圖9顯示，固定料液比為1∶25時，乙醇濃度與提取溫度的交互作用顯著，在相對較低溫度、高乙醇濃度的范圍內，可獲得較高的提取率;當提取溫度為57.6℃，乙醇體積分數(shù)為68.9%時，預測提取率可達88.79%。

2.4 北五味子多糖對·OH、·清除率測定結果

3 結論

圖10 北五味子多糖對·OH、·清除能力

本文采用單因素結合響應曲面法對超聲輔助乙醇提取條件進行了研究，并考察了北五味子多糖的抗氧化性能。結果表明，乙醇濃度，溫度，料液比對北五味子多糖提取率有顯著影響，采用Box-Behnken實驗設計建立了關鍵影響北五味子多糖提取率的二次多項式:北五味子多糖提取率Y=86.63－2.54 X2－3.03 X3－5.03－7.60－2.43X1X2+6.35 X2X3，得到最佳提取條件為:乙醇濃度X1=54.7%、料液比X2=1∶25、提取溫度X3=58℃;其他條件為:超聲功率200 W，提取時間40 min，提取次數(shù)2次，在此條件下，北五味子多糖相對提取率為87.12%(n=3)，優(yōu)于傳統(tǒng)的水提法和醇提法。北五味子多糖具有較強的抗氧化性能，當濃度為1.2 mg/mL時，·OH、清除率分別為66.7%、44.5%。

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