硼處理對楊梅果實(shí)采后貯藏期間蔗糖代謝及花色苷合成的影響*

汪開拓，鄭永華

1(重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶，404100)2(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

楊梅(Mycira rubra Sieb.et Zucc.)為我國特產(chǎn)的漿果類水果，加工和消費(fèi)需求量很大，商業(yè)價(jià)值很高。同時(shí)，楊梅果實(shí)中還富含多種可溶性糖及多酚、花色苷和類黃酮等抗氧化物質(zhì)，因而賦予楊梅果實(shí)濃郁的風(fēng)味、鮮艷的色澤以及較高的抗氧化活性［1］。這其中，蔗糖及花色苷含量是決定采后楊梅果實(shí)品質(zhì)的主要因素［2］。近年來，對我國廣泛種植的楊梅品種——“烏種”楊梅果實(shí)(Mycira rubra Sieb.et Zucc.Cv Wumei)采后生理的研究表明，其采后果實(shí)組織中蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)和合成方向的蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)活性一直維持在較高水平，從而催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和磷酸果糖或果糖合成蔗糖，促進(jìn)楊梅果實(shí)在采后貯藏期間蔗糖的積累［3］;但筆者先前研究發(fā)現(xiàn)，“烏種”楊梅果實(shí)主要花色苷類物質(zhì)的矢車菊-3-葡萄糖苷含量在貯藏期間緩慢下降［4］。由于蔗糖以及矢車菊-3-葡萄糖苷合成的主要前體物質(zhì)均為UDPG，因此推測植物花色苷和蔗糖合成之間可能存在一定的底物競爭關(guān)系［5－7］。通過對采后楊梅果實(shí)蔗糖代謝和苯丙烷類代謝的調(diào)控，平衡蔗糖和花色苷合成對底物的競爭關(guān)系，可有效促進(jìn)楊梅果實(shí)采后品質(zhì)的形成，提升果實(shí)風(fēng)味和功能性。

硼作為果樹生長發(fā)育以及果實(shí)品質(zhì)形成所必需的微量元素，具有穩(wěn)定葉綠素和花色苷結(jié)構(gòu)、促進(jìn)碳水化合物運(yùn)輸以及蛋白質(zhì)合成的作用，即在果實(shí)采后糖代謝以及花色苷合成等方面具有重要的調(diào)控作用［8］。同時(shí)，研究表明大鼠硼元素急性中毒的LD50為550～710 mg/kg，因此外源硼處理的安全性較高［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道，采后富硼處理可有效減輕桃果實(shí)采后果心褐變程度［10］，顯著抑制采后葡萄灰霉?。?1］和紅棗青霉?。?2］的發(fā)生，同時(shí)提高番茄果實(shí)番茄紅素的合成［12］。但現(xiàn)階段有關(guān)硼元素在楊梅果實(shí)采后貯藏期間蔗糖代謝以及花色苷合成中的作用卻尚未見報(bào)道。因此，本研究首先分析了不同濃度外源硼處理對楊梅果實(shí)內(nèi)源硼含量以及冷藏期間楊梅果實(shí)品質(zhì)的影響，再從蔗糖代謝和花色苷合成的角度探討硼元素調(diào)控采后楊梅果實(shí)品質(zhì)形成的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與主要試劑

以重慶市萬州區(qū)燕山鄉(xiāng)種植的“烏種”楊梅果實(shí)(Mycira rubra Sieb.et Zucc.Cv.Wumei)為試材，采摘期分別為2010年6月和2011年6月，于采收后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。挑選無病蟲害和機(jī)械傷且大小基本相同、著色均勻的八分熟楊梅果實(shí)，平攤自然風(fēng)預(yù)冷。

FHM－5型果實(shí)硬度計(jì)，浙江托普儀器有限公司;PAL－1型手持?jǐn)?shù)顯折光儀，北京首選科技有限公司;PHS－3C酸度計(jì)，中山科技發(fā)展公司;UV－1600型分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;5424型臺式冷凍離心機(jī)，德國艾德本公司;GHP－9080型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠;PL601－S型電子天平，梅特勒-托利多公司;DW－40L92超低溫冰箱，海爾公司;LC－20A型高效液相色譜儀，日本島津公司。

姜黃素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Triton X－100、二硫蘇糖醇(DTT)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、G-250考馬斯亮藍(lán)上?；瘜W(xué)試劑公司;3，5-二硝基水楊酸(DNS)、蒽酮、MgCl2西隴化工有限公司;6-磷酸果糖、UDPG、矢車菊-3-葡萄糖苷 美國Sigma公司;甲醇、甲酸、乙腈、葡萄糖、果糖和蔗糖為國產(chǎn)色譜純，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 材料處理

實(shí)驗(yàn)分2次進(jìn)行。第一次實(shí)驗(yàn)的主要目的是篩選最適硼(四硼酸鉀)處理濃度。以2010年采摘的楊梅果實(shí)為試材，首先將挑選出的楊梅果實(shí)隨機(jī)分為10組，在實(shí)驗(yàn)臺上平攤開，再分別用0(對照)、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 和 100 g/L 的四硼酸鉀溶液進(jìn)行噴灑處理(環(huán)境溫度20℃)。處理結(jié)束后，將各處理果實(shí)通風(fēng)2 h，其中部分果實(shí)用無菌手術(shù)刀仔細(xì)切取果實(shí)肉柱后測定其中硼元素含量，其余各處理組果實(shí)用的聚乙烯塑料盒(20 cm×12 cm×8 cm)分裝，于(1±1)℃、(90±5)%RH下貯藏12 d后測定果實(shí)腐爛率、硬度、pH值、可溶性固形物和可滴定酸含量。每個(gè)處理約300顆左右楊梅果實(shí)，分裝20盒左右，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

第二次實(shí)驗(yàn)在2010年實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以經(jīng)研究確定的10 g/L四硼酸鉀噴灑處理?xiàng)蠲饭麑?shí)、研究硼元素對楊梅果實(shí)貯藏期間蔗糖代謝及花色苷合成的調(diào)控機(jī)制。試材為2011年采摘的楊梅果實(shí)，將挑選出的楊梅果實(shí)隨機(jī)分為2組，處理組用1%四硼酸鉀進(jìn)行噴灑處理，而對照組則用無菌水進(jìn)行處理。處理結(jié)束后，將楊梅果實(shí)通風(fēng)2 h后用聚乙烯塑料盒分裝，再在(1±1)℃、(90～95)%RH環(huán)境中貯藏12 d。分別在果實(shí)處理前(0 d)和處理后冷藏期間每隔3 d取樣，用液氮速凍后在－60℃的超低溫冰箱中保存，用于蔗糖代謝酶活性、可溶性糖和花色苷單體含量的測定。每個(gè)處理約500顆楊梅果實(shí)，分裝為35盒左右，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 腐爛率

楊梅果實(shí)表面出現(xiàn)霉菌性病斑即記為爛果。

腐爛率/%=(爛果數(shù)/總果數(shù))×100

1.3.2 果實(shí)可溶性固型物含量(TSS)、可滴定酸含量(TA)和pH值測定

用手持?jǐn)?shù)顯折光儀測定 TSS含量;采用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定法測定TA含量，結(jié)果以蘋果酸百分含量表示。用pH計(jì)(PHS－3C)測定果汁的pH值。

1.3.3 果實(shí)硬度測定

采用手持果實(shí)硬度計(jì)測定楊梅果實(shí)硬度(kg/cm－2)。

1.3.4 硼元素含量測定

取5 g果實(shí)凍樣用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaOH溶液勻漿后轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，然后在35℃下低速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約10 mL，再加入5 mL 1∶1硫酸后用蒸餾水定容至50 mL待測。楊梅果實(shí)中硼元素含量參照姜黃素比色法進(jìn)行測定［13］，結(jié)果以mg/kg鮮重表示。

1.3.5 蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、分解方向的蔗糖合成酶(SS1)和合成方向的蔗糖合成酶(SS2)活性的測定

蔗糖代謝相關(guān)酶參照陳俊偉等［3］的方法進(jìn)行提取，略有改進(jìn)。取10 g果實(shí)凍樣經(jīng)真空冷凍干燥后冰浴研磨成粉末，加入提取緩沖液(內(nèi)含50 mmol/L Hepes-KOH、5 mmol/LMgCl2、1 mmol/LEDTA、1 mmol/L EGTA、10% 甘油、0.1%Triton X-100、5 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF、1 g/L PVPP，調(diào) pH 值至 8.2)50 mL并冰浴勻漿，隨后冷凍離心20 min(10 000×g、2℃)，取上清液裝入透析袋內(nèi)，于2℃下過夜脫鹽后測定酶活性和蛋白質(zhì)含量。以考馬斯亮藍(lán)法［14］測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

AI活性參照Lowell等［15］的方法進(jìn)行測定，反應(yīng)體系內(nèi)含30 mmol/L醋酸-磷酸鉀緩沖液(pH 4.5)、50 mmol/L蔗糖以及酶提取液，30℃下水浴反應(yīng)1 h后用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定反應(yīng)液中還原糖含量。以反應(yīng)液1 h生成1 μmol還原糖為一個(gè)酶活性單位;SPS活性參照Hubbard等［16］的方法進(jìn)行測定，反應(yīng)體系內(nèi)含50 mmol/L Tris-HCL緩沖液(pH 7.5)、15 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 6-磷酸果糖、2 mmol/L UDPG以及酶提取液，30℃下水浴反應(yīng)1 h后用蒽酮比色法測定其中反應(yīng)液中總糖含量，以反應(yīng)液1 h生成1 μmol總糖為一個(gè)酶活性單位;SS1和SS2活性參照趙智中等［17］的方法進(jìn)行測定，SS1反應(yīng)體系內(nèi)含50 mmol/L醋酸緩沖液(pH 5.5)、1 mmol/L UDP、20 mmol/L 蔗糖以及酶提取液;SS2反應(yīng)體系內(nèi)含50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)、5 mmol/L MgCl2、15 mmol/L 果糖、2 mmol/L UDPG以及酶提取液，30℃下水浴1 h后測定其中還原糖含量，以反應(yīng)液1 h生成1 μmol還原糖為一個(gè)酶活性單位。以上結(jié)果均以U/mg蛋白表示。

1.3.6 可溶性糖組分含量測定

可溶性糖組分含量的測定參照Cao等［18］的方法進(jìn)行。取2 g果實(shí)凍樣用20 mL 95%冷乙醇勻漿，震蕩提取10 min，在冷凍離心15 min(10 000 ×g、2℃)，取沉淀物用體積分?jǐn)?shù)95%冷乙醇以相同流程進(jìn)行復(fù)提。合并2次上清液于35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至乙醇全部揮發(fā)，殘留組分用超純水定容至25 mL，再用孔徑為0.45 μm纖維膜微濾后進(jìn)行HPLC分析。可溶性糖組分含量采用島津LC－20A型高效液相色譜儀進(jìn)行測定。該色譜儀由以下幾個(gè)部分組成:在線脫氣裝置(DGU－14A)，二元泵(LC－20AT)，柱溫箱(CTO－20AC)和示差折光檢測器(RID－10A)。手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20 μL。分析色譜柱為Zorbax糖分析柱，250 mm × 4.6 mm i.d.，10 μm，柱溫為 35℃，流速0.8 mL/min，流動(dòng)相為75%的乙腈。以外標(biāo)法測定可溶性糖組分含量，其結(jié)果均以mg/g鮮重表示。

1.3.7 花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷含量測定

取1 g果實(shí)凍樣用5 mL丙酮?jiǎng)驖{并離心，取上清液用于總花色苷及其單體矢車菊-3-葡萄糖苷含量的測定。采用Cheng和Breen［19］的pH差異法測定果實(shí)總花色苷含量;同時(shí)將上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后過C18Sep-Pak(Supelco公司)萃取小柱后再經(jīng)0.45 μm孔徑的纖維膜過濾，取濾液參照筆者先前的高效液相色譜法測定其中矢車菊-3-葡萄糖苷含量［20］。以上結(jié)果均以mg/g鮮重表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上各指標(biāo)測定除腐爛率和硬度重復(fù)10次外，其余指標(biāo)均重復(fù)3次。運(yùn)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，5%為顯著水平，1%為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硼處理后楊梅果實(shí)中硼元素含量變化

如圖1所示，經(jīng)0.1 g/L硼處理后的楊梅果實(shí)中硼元素含量較對照水平相比無顯著(P＞0.05)差異;而濃度高于0.5 g/L的硼處理均可顯著(P＜0.05)提高楊梅果實(shí)中硼元素含量，且果實(shí)中硼元素含量隨硼處理濃度的上升而逐漸增加;但當(dāng)硼處理濃度高于10 g/L時(shí)，各處理后楊梅果實(shí)中硼元素含量無顯著(P＞0.05)差別，暗示楊梅組織對硼元素吸收能力達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，綜合圖1的結(jié)論，選擇濃度為0.1、1.0、5.0和10 g/L的硼處理來進(jìn)行楊梅保鮮實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度硼處理后楊梅果實(shí)中硼元素含量變化

2.2 不同濃度硼處理對楊梅果實(shí)貯藏品質(zhì)的影響

貯藏前的楊梅果實(shí)硬度為(4.31±0.09)kg/cm2;可溶性固形物和可滴定酸含量經(jīng)測定分別為(10.24±0.15)%和(0.86±0.07)%。

如表1所示，對照楊梅果實(shí)在1℃貯藏12 d后，其腐爛率達(dá)到39.42%;同時(shí)，果實(shí)中硬度、TSS和TA含量也較貯藏前分別下降了14.38%、8.49%和19.05%，這些數(shù)據(jù)顯示冷藏12 d后楊梅果實(shí)食用品質(zhì)明顯下降，基本失去商品性。而經(jīng)0.1～10 g/L的硼處理可顯著(P＜0.05)抑制楊梅果實(shí)在貯藏期間腐爛率的上升，并在一定程度上維持果實(shí)TSS和TA含量，從而維持了果實(shí)品質(zhì)。其中，經(jīng)5～10 g/L硼處理?xiàng)蠲饭麑?shí)的腐爛率均顯著(P＜0.05)低于0.1和1 g/L處理組，10 g/L硼處理的楊梅果實(shí)TA含量又顯著(P＜0.05)高于5 g/L硼處理。綜合品質(zhì)結(jié)果表明，10 g/L硼處理對楊梅果實(shí)保鮮效果最佳，以此處理作為下一步機(jī)理研究的處理?xiàng)l件。

2.3 10 g/L硼處理對楊梅果實(shí)采后貯藏期間蔗糖代謝酶活性的影響

如圖2所示，對照楊梅果實(shí)在1℃貯藏期間，其酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AI)活性隨貯藏時(shí)間延長而緩慢上升，而SPS則在貯藏期間急劇上升，至貯藏結(jié)束時(shí)，SPS活性為貯藏前的1.21倍;SS1(蔗糖合成酶分解方向)活性在貯藏前3 d明顯上升，隨后緩慢上升;SS2(蔗糖合成酶合成方向)活性則在貯藏期間無顯著變化。這些結(jié)果顯示，楊梅果實(shí)在貯藏期間，其組織內(nèi)蔗糖呈緩慢合成趨勢。10 g/L硼處理顯著(P＜0.05)延緩了楊梅果實(shí)在貯藏期間AI和SPS活性在貯藏期間的上升，并抑制了SS2活性的上升;但10 g/L硼處理卻顯著(P＜0.05)誘導(dǎo)了SS1活性的上升，使處理果實(shí)中SS1活性在整個(gè)貯藏期間均顯著(P＜0.05)高于對照果實(shí)。由此可推測，經(jīng)10 g/L硼處理后，楊梅果實(shí)蔗糖合成受到明顯抑制的同時(shí)，蔗糖分解速率加快，從而使蔗糖代謝中間產(chǎn)物UDPG逐漸積累。

表1 不同濃度硼處理對1℃貯藏12 d后楊梅果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的影響

圖2 1%硼處理對貯藏期間楊梅果實(shí)中AI(A)、SPS(B)、SS1(C)和SS2(D)活性的影響

2.4 10 g/L硼處理對楊梅果實(shí)采后貯藏期間可溶性糖組分的影響

葡萄糖、果糖和蔗糖為楊梅果實(shí)中主要的可溶性糖。如圖3所示，對照楊梅果實(shí)在1℃貯藏期間，其果糖含量基本保持穩(wěn)定;葡萄糖含量在貯藏前6 d逐漸上升，隨后呈現(xiàn)急速下降趨勢;而蔗糖含量在貯藏前6 d無顯著變化，隨后逐漸上升。經(jīng)10 g/L硼處理的楊梅果實(shí)中葡萄糖和蔗糖含量在整個(gè)貯藏期間均顯著(P＜0.05)低于對照果實(shí)，而處理果實(shí)中果糖含量卻在貯藏6 d后逐漸高于對照果實(shí)。

2.5 10 g/L硼處理對楊梅果實(shí)采后貯藏期間總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷(C3G)含量的影響

如圖4所示，對照楊梅果實(shí)在1℃貯藏期間，其總花色苷含量及其主要單體物質(zhì)矢車菊-3-葡萄糖苷含量無顯著(P＞0.05)變化，10 g/L硼處理顯著(P＜0.05)促進(jìn)了楊梅果實(shí)在貯藏期間花色苷以及花色苷主要單體物質(zhì)矢車菊-3-葡萄糖苷的積累，使處理果實(shí)中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷含量在整個(gè)貯藏均顯著(P＜0.05)高于對照水平。

3 討論

3.1 最佳硼(四硼酸鉀)處理濃度的篩選

本研究結(jié)果證實(shí)楊梅果實(shí)內(nèi)硼元素的積累隨硼(四硼酸鉀)處理濃度的上升而顯著增加，但當(dāng)處理濃度大于10 g/L時(shí)，果實(shí)內(nèi)硼元素含量不再明顯增加，由此推測10 g/L為楊梅果實(shí)最大有效硼處理濃度。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)10 g/L硼處理可以顯著降低楊梅果實(shí)采后貯藏期間腐爛率，并顯著延緩果實(shí)TSS、TA和硬度的下降，從而全面維持了果實(shí)食用品質(zhì)，這與前期有關(guān)0.5～10 g/L硼處理有效抑制如葡萄［11］和紅棗［12］采后腐爛發(fā)生和品質(zhì)下降的結(jié)論相一致，其機(jī)理可能是由于硼元素可直接破壞果實(shí)病原菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而阻止病原菌的侵染，而小于10 g/L的硼處理抑菌效果有限［10］。

圖3 1%硼處理對貯藏期間楊梅果實(shí)中葡萄糖(A)、果糖(B)和蔗糖(C)含量的影響

圖4 10 g/L硼處理對貯藏期間楊梅果實(shí)中總花色苷(A)和矢車菊-3-葡萄糖苷(B)含量的影響

3.2 硼處理對楊梅果實(shí)蔗糖代謝及花色苷合成的調(diào)控機(jī)制分析

在果實(shí)品質(zhì)形成過程中，其組織內(nèi)蔗糖主要通過磷酸蔗糖合酶和蔗糖合酶2種途徑進(jìn)行合成，同時(shí)類黃酮、酚酸和花色苷等抗氧化成分的合成則主要通過苯丙烷類代謝途徑進(jìn)行，而UDPG是這幾種代謝途徑共同的中間體:UDPG既是苯丙烷類代謝途徑中合成花色苷類物質(zhì)中碳骨架的主要底物，同時(shí)也作為磷酸蔗糖合酶途徑中葡萄糖的供體并且為蔗糖合酶途徑中蔗糖的合成提供活化的單糖基［21］;而UDPG含量主要由蔗糖代謝相關(guān)酶進(jìn)行調(diào)控:SPS可催化UDPG和6-磷酸果糖合成6-磷酸蔗糖，而6-磷酸蔗糖可迅速降解成蔗糖和磷酸根離子;SS1(蔗糖合酶合成方向)可催化UDPG和果糖合成蔗糖，而SS2(蔗糖合酶分解方向)可將蔗糖反向分解為UDPG和果糖;IA可催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，從而維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)節(jié)蔗糖和己糖的貯存并為UDPG的合成提供底物［22］。在本實(shí)驗(yàn)中，10 g/L硼處理顯著降低了楊梅果實(shí)在1℃貯藏期間AI、SPS以及SS2的活性，并有效誘導(dǎo)了SS1活性的上升;同時(shí)經(jīng)過10 g/L硼處理的楊梅果實(shí)在整個(gè)貯藏期間，其葡萄糖和蔗糖含量卻顯著低于對照果實(shí)。結(jié)合硼處理可提升楊梅果實(shí)內(nèi)硼元素含量的結(jié)論，由此推斷硼元素可直接調(diào)控楊梅果實(shí)中蔗糖代謝酶活性，即通過降低楊梅果實(shí)貯藏期間AI、SPS以及SS2活性從而降低6-磷酸蔗糖和蔗糖合成速率，使中間產(chǎn)物UDPG積累;同時(shí)通過誘導(dǎo)果實(shí)SS1活性的上升來促進(jìn)蔗糖分解為UDPG。另一方面，10 g/L硼處理可顯著促進(jìn)楊梅果實(shí)在貯藏期間總花色苷和花色苷主要單體物質(zhì)矢車菊-3-葡萄糖苷的合成，而UDPG則是花色苷合成途徑——苯丙烷類代謝途徑中重要的前體物質(zhì)。因此，這些結(jié)論說明硼元素可通過調(diào)控楊梅果實(shí)貯藏期間蔗糖代謝酶活性來減慢蔗糖合成速率并降解蔗糖以積累UDPG，從而為楊梅果實(shí)花色苷的合成提供底物，最終達(dá)到促進(jìn)果實(shí)中功能性物質(zhì)的積累并改善果實(shí)的貯藏品質(zhì)的目的，這些結(jié)論與有關(guān)蔗糖分解積累UDPG促進(jìn)模式植物擬南芥花色苷積累的結(jié)論基本一致［7］。但硼元素在采后楊梅果實(shí)中的形態(tài)及其具體功能還有待進(jìn)一步研究。

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