薔薇藻藻藍(lán)蛋白的分離純化及其體外抗氧化活性*

張艷燕，陳必鏈

1(龍巖出入境檢驗檢疫局，福建 龍巖，364000)2(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州，350108)3(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州，350108)

藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻(Cyanophyta)、紅藻(Rhodophyta)和隱藻(Cryptophyta)等藻類特有的一種水溶性捕獲光能的蛋白，主要包括藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，PC)和別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)3種。藻藍(lán)蛋白是一種主要的捕光色素蛋白，具有熒光、抗癌、抗氧化和抗炎癥特性，根據(jù)來源不同，藻藍(lán)蛋白可以分為兩種類型:R-PC和C-PC。不同類型的藻藍(lán)蛋白，在氨基酸序列和光學(xué)性質(zhì)等方面不盡相同。藻藍(lán)蛋白鮮亮的藍(lán)色是由于共價結(jié)合線性四吡咯輔基，通常又稱為膽汁三烯。在所有的5種膽汁三烯色素中，有不同數(shù)量和排列的共軛雙鍵。藻藍(lán)蛋白的總分子質(zhì)量一般為140～210 ku，含有α和β兩個亞基，亞基分子量在15 ku至22 ku之間。藻藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)顯示它含有一個類似于三聚體的構(gòu)造，亞基間相互關(guān)聯(lián)形成(αβ)原聚體，單體間借助連接多肽的作用再聚合成(αβ)3和(αβ)6，后者是藻膽蛋白體的功能單位［1］。藻藍(lán)蛋白的α和β亞基均由載體蛋白(脫輔基蛋白)和發(fā)色團(色基，開環(huán)線性延展的四吡咯化合物)組成，色基通過硫醚鍵與脫輔基蛋白的半胱氨酸殘基交聯(lián)，每個亞基有1～4分子發(fā)色基。

薔薇藻(Rhodella reticulata)是屬于紅藻門的一種海洋單細(xì)胞紅藻，富含藻藍(lán)蛋白等生物活性物質(zhì)。隨著光強度的增大，薔薇藻的生物量隨之提高，而在同等條件下，藻膽蛋白的含量卻減少［2］。該藻以硝酸鉀為氮源，濃度為0.75 g/L的條件下生長最好，得到最大的藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量［3］。在薔薇藻培養(yǎng)基中加入除草劑2，6-dichlorobenzonitrile(DCB)，將引起藻細(xì)胞發(fā)生抗DCB的自發(fā)突變。在穩(wěn)定期加入DCB，不影響藻細(xì)胞數(shù)量但會抑制多糖的產(chǎn)量［4］。通過可控的水解方法檢測到薔薇藻多糖的糖基組成，它至少由10種單糖組成，含木糖、葡萄糖、半乳糖、甲基戊糖、甲基己糖、鼠李糖等［5］。本課題組比較經(jīng)過不同處理的薔薇藻胞外多糖的清除自由基和抗氧化能力，實驗結(jié)果表明，無論是粗胞外多糖還是去蛋白的胞外多糖，其清除自由基和抗氧化能力均呈劑量效應(yīng)［6］。通過超聲波處理薔薇藻，可不同程度地提高生物量、藻藍(lán)蛋白、胞外多糖等含量［7］。本文論文主要研究薔薇藻藻藍(lán)蛋白分離純化，以及不同純度的藻藍(lán)蛋白的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 藻種

薔薇藻(Rhodella reticulata)FACHB 742，購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所。

培養(yǎng)基及藻的培養(yǎng):

KOCK液體培養(yǎng)基(g/L)中:KH2PO40.025、KNO30.75、MgSO4·7H2O 1.95、FeCt 0.002 5、NaCl 12.5、KCl 0.4、MgCl2·6H2O 1.25、CaCl2·2H2O 0.6、NaHCO30.1、ViB1225 μg/L、土壤浸出液 1 mL/L。

薔薇藻的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行，培養(yǎng)至第8天收集藻粉。

1.2 薔薇藻藻藍(lán)蛋白分離純化方法

稱取5g薔薇藻凍干粉加50 mL蒸餾水于冰箱中浸提過夜，充分浸提后于高速冷凍離心機，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液。沉淀的藻泥加50 mL蒸餾水繼續(xù)浸提過夜2次，合并3次浸提所得上清液為藻藍(lán)蛋白粗提液，即粗蛋白，記為crude PC。粗提液加入固體硫酸銨至飽和度分別為0%、20%、40%和60%，靜置過夜，高速冷凍離心機，4℃、12 000 r/min離心20 min，取沉淀，將沉淀溶于少量蒸餾水裝入透析袋中，4℃蒸餾水透析24 h，然后用0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液(PBS)pH 7.0平衡透析24 h。將透析后的樣品于高速冷凍離心機，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，即為上樣樣品。將藻膽蛋白粗品上樣于用0.01 mol/L PBS(pH 7.0)緩沖液平衡好的 DEAE-Sepharose FF柱，用0.125～0.50 mol/L NaCl作梯度洗脫，洗脫液總體積為500 mL，流速1.5 mL/min，每管收集約5 mL。將收集到的各管測其280 nm和620 nm處的光吸收值。根據(jù)吸收峰和OD620/OD280值，收集較純的樣品，記為 pure PC。將收集到的較純的樣品透析、濃縮、凍干后備用。

1.3 藻藍(lán)蛋白的純度鑒定

(1)藻藍(lán)蛋白紫外可見光區(qū)光譜特性測定，利用752紫外光柵分光光度計對純化的藻藍(lán)蛋白樣品在220～800 nm紫外-可見光區(qū)進(jìn)行光譜掃描。

(2)SDS-PAGE電泳，將純化的樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%，并用考馬斯亮蘭R-250染色，以檢測樣品的亞基組成及其分子量。

(3)藻藍(lán)蛋白純度的光學(xué)表示法，用藻藍(lán)蛋白溶液在最大可見光吸收峰處的吸光值與蛋白質(zhì)特征吸收峰的吸光值之比(ODmax/OD280)來表示。

1.4 藻藍(lán)蛋白的氨基酸組成

用日立L8800高效氨基酸分析儀，天冬氨酸、蘇氨酸等16種氨基酸依據(jù)GB/T 5009.124－2003食品中氨基酸的測定方法檢測藻藍(lán)蛋白的氨基酸含量(色氨酸檢測采取6 mol/L NaOH進(jìn)行堿水解)，并充入少量氮氣，在酒精噴燈下迅速封管后置于110℃烘箱中水解22 h，取出冷卻，過濾并濃縮，加蒸餾水溶解并定容至50 mL，即得待測樣品溶液。

1.5 藻藍(lán)蛋白體外抗氧化活性

抗羥自由基(·OH)能力的測定參照Smirnoff and Cumbes［8］方法，亞油酸自動氧化抑制試驗(FOX化驗)參照文獻(xiàn)［9］的方法，抗超氧陰離子自由基·)能力和總抗氧化能力(T-AOC)的測定均采用試劑盒進(jìn)行測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，以Vc為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 薔薇藻藻藍(lán)蛋白的分離純化

薔薇藻的水溶性蛋白提取液經(jīng)硫酸銨分級沉淀，結(jié)果見表1。

表1 硫酸銨飽和度對提取藻藍(lán)蛋白的影響

由表1可知，當(dāng)硫酸銨飽和度為40%時，藻藍(lán)蛋白的純度最高，OD620nm/OD280nm為1.156，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他飽和度的硫酸銨沉淀結(jié)果。因此，可選擇飽和度為20%的硫酸銨去除薔薇藻的雜蛋白，再用40%飽和度的硫酸銨沉淀目的蛋白即粗藻藍(lán)蛋白。硫酸銨沉淀所得藻藍(lán)蛋白粗品上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，從DEAE-Sepharose FF離子交換層析的洗脫圖譜(圖1)可以看出，在整個層析過程中280 nm處有3個吸收峰。第1個峰最大，為穿透峰，無色，是沒有吸附上的雜蛋白。第2個峰較小，是用0.25 mol/L NaCl洗脫下來的藍(lán)色的目的蛋白，即純藻藍(lán)蛋白，記為pure PC。最后出來的峰是用0.50 mol/L NaCl洗脫下來的一個藍(lán)紫色蛋白峰，即別藻藍(lán)蛋白。

圖1 DEAE Sepharose FF離子交換洗脫圖譜

2.2 藻藍(lán)蛋白純度鑒定

用紫外光柵分光光度計在220～800 nm檢測經(jīng)DEAE Sepharose FF離子交換層析后收集所得到的藻藍(lán)蛋白，觀察藻藍(lán)蛋白在紫外和可見光譜區(qū)的吸收特性，結(jié)果見圖2。

圖2顯示，薔薇藻藻藍(lán)蛋白在光譜的可見光區(qū)域顯示很強的吸收值，在620 nm處有最大的吸收峰，并且是單一的吸收峰，說明通過經(jīng)過離子交換柱層析后，已得到純藻藍(lán)蛋白。

圖2 藻藍(lán)蛋白紫外可見光吸收光譜圖

將經(jīng)過離子交換柱層析的樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12%，電壓為200 v，時間50 min，上樣量為5 μL，并用考馬斯亮蘭R-250染色，以檢測樣品的亞基組成及其分子量，結(jié)果見圖3。

圖3 考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE電泳圖

由圖3可見，SDS變性條件使藻藍(lán)蛋白分離成兩部分，泳道1清晰地呈現(xiàn)出兩條染色帶，分子量分別為18 ku和22 ku左右，說明薔薇藻的藻藍(lán)蛋白含有α和β兩個亞基。這與文獻(xiàn)所報道的α亞基的分子量在15～20 ku之間，β亞基的分子量在17～22 ku 間相符［10］。

薔薇藻藻藍(lán)蛋白經(jīng)過粗提、硫酸銨鹽析、DEAE Sepharose FF離子交換柱層析等步驟的純化，結(jié)果見表2。

藻藍(lán)蛋白的純度標(biāo)準(zhǔn)一般用OD620nm/OD280nm來表示，由表2可知，薔薇藻藻藍(lán)蛋白粗提液的純度為0.422，經(jīng)過2次硫酸銨沉淀，純度上升為1.156，再經(jīng)DEAE Sepharose FF柱層析后，純度提高到3.92，已達(dá)到反應(yīng)純(reactive grade)［11］，但是收率下降很快，最后得到的總收率為19.45%。

表2 薔薇藻藻藍(lán)蛋白各級純化結(jié)果

2.3 薔薇藻藻藍(lán)蛋白的氨基酸組成

取一定量的凍干的純藻藍(lán)蛋白，檢測純藻藍(lán)蛋白的氨基酸組成及含量，結(jié)果見表3。

表3 薔薇藻藻藍(lán)蛋白的氨基酸組成

由表3可知，薔薇藻藻藍(lán)蛋白由17種氨基酸組成，氨基酸總含量為15.60%，其中以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸含量較高，分別為 1.89%、1.64%、1.53%和1.48%。

2.4 薔薇藻藻藍(lán)蛋白體外抗氧化活性

不同濃度(0.03，0.06，0.12，0.24，0.48 mg/mL)的薔薇藻粗藻藍(lán)蛋白(crude PC)和純藻藍(lán)蛋白(pure PC)溶液對羥自由基的清除能力見圖4，對亞油酸自動氧化的抑制率見圖5，對超氧陰離子的清除能力見圖6，總抗氧化能力見圖7。

由圖4可見，薔薇藻藻藍(lán)蛋白對羥自由基·OH表現(xiàn)出較高的清除能力，在試驗所選的濃度范圍內(nèi)，藻藍(lán)蛋白的濃度與清除率呈現(xiàn)出量效關(guān)系，且純藻藍(lán)蛋白的清除率高于粗藻藍(lán)蛋白，高于同濃度下的Vc對照組的清除率。

圖5 粗PC和純PC對亞油酸自動氧化的抑制率

由圖5可知，在FOX實驗中，藻藍(lán)蛋白以劑量依賴方式抑制氧化性損傷，并且純化后的藻藍(lán)蛋白比粗藻藍(lán)蛋白在同等濃度下抑制率更高。當(dāng)藻藍(lán)蛋白濃度為0.48 mg/mL時，薔薇藻粗藻藍(lán)蛋白和純化后的藻藍(lán)蛋白對亞油酸自動氧化的抑制率分別為59.37%和70.58%。

圖6 粗PC和純PC對超氧陰離子的清除率

如圖6所示，薔薇藻藻藍(lán)蛋白對超氧陰離子具有較強的清除作用，且純化后的藻藍(lán)蛋白的清除效果更好。當(dāng)純藻藍(lán)蛋白的濃度為0.48 mg/mL時，其清除超氧陰離子自由基的活力為618.89 U/L，遠(yuǎn)高于對照組，可見薔薇藻藻藍(lán)蛋白有很好的抗超氧能力。

圖7 粗PC和純PC的總抗氧化能力

由圖7可知，薔薇藻純化后的藻藍(lán)蛋白比粗藻藍(lán)蛋白具有更高的總抗氧化能力，且呈劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)藻藍(lán)蛋白濃度為0.48 mg/mL時，其總抗氧化能力分別為5.22和8.13 U/mL。

3 討論

反復(fù)凍融是一種溫和的非變性條件下提取藻膽蛋白的有效方法，通過兩步硫酸銨沉淀能有效地去除雜蛋白，同時獲得高濃度的藻藍(lán)蛋白。硫酸銨作為沉淀試劑，它能使蛋白保持完整性，并能快速沉淀藻膽蛋白，從而減少操作過程中樣品量的損失，硫酸銨在低溫下具有高水溶性并且還有抑菌作用，這些特性都有助于蛋白的分離純化。本實驗用兩步分級沉淀:初始的20%飽和度沉淀除藻膽蛋白以外的雜蛋白，然后用40%飽和度的硫酸銨沉淀藻藍(lán)蛋白。經(jīng)過DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱層析后，得到純度為3.92的純藻藍(lán)蛋白，這個值可與前人所報道的關(guān)于藻藍(lán)蛋白純化相當(dāng)［12－13］，經(jīng)兩步硫酸銨沉淀和DE 52過柱后，純化后的螺旋藻藻藍(lán)蛋白其吸光度比值(A620/A280)為4.69［14］。薔薇藻純化后的藻藍(lán)蛋白在620 nm處有唯一的吸收峰，這符合藻藍(lán)蛋白本身所具有的獨特性質(zhì)，Soni等［12］報道藻藍(lán)蛋白的最大吸收峰在610～620 nm之間。

SDS-PAGE電泳用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果得到兩條明顯的條帶，說明藻藍(lán)蛋白含有兩個亞基，且α亞基的分子量為18 ku，β亞基的分子質(zhì)量為22 ku，這與前人報道的α亞基的分子質(zhì)量在15～20 ku之間，β亞基的分子質(zhì)量在17～22 ku間相符［10］。Sarada［14］等報道螺旋藻的兩個亞基分子質(zhì)量分別為19 ku和 20 ku。Minkova等［15］用紫外可見光譜法及SDS-PAGE證明螺旋藻藻藍(lán)蛋白的純度，Madhyastha等［16］也是用以上方法鑒定螺旋藻藻藍(lán)蛋白的純度。

海藻跟一般的蔬菜相比，就必需氨基酸的含量來說是相當(dāng)?shù)模袔缀跻话氲谋匦璋被?，而且其蛋白質(zhì)剖析圖與雞蛋蛋白質(zhì)的剖析圖非常相近［17］。薔薇藻的藻藍(lán)蛋白含有17種氨基酸，其中以天冬氨酸和谷氨酸含量最高，含量分別為12.12%和10.51%。歐瑜等［18］從鹽生隱桿藻中分離得到藻藍(lán)蛋白，測得藻藍(lán)蛋白的17種氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp和Glu)含量最高。螺旋藻的藻藍(lán)蛋白中的氨基酸也以Asp和Glu最高，含量分別為12.8%和13.5%［19］。

自由基，如羥基(·OH)、超氧自由基(O2－·)、過氧化氫自由基(ROO·)等，都產(chǎn)生于有氧代謝［20］。自由基反應(yīng)，特別是參加氧化作用的自由基，與許多生理過程有關(guān)，比如破壞脂類、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜、核酸，最后導(dǎo)致許多疾?。?1］。Benedetti等［22］從 Aphanizom-enon flos-aquae提取的藻藍(lán)蛋白具有抗氧化活性，在體外能保護(hù)人類紅細(xì)胞和血漿樣品抗擊氧化損傷。Estrada等［23］從螺旋藻提取的藻藍(lán)蛋白可以很好地清除羥基氫氧基和過氧化氫自由基，阻止微粒體脂質(zhì)過氧化，并發(fā)現(xiàn)成劑量依賴效應(yīng)。同樣的實驗結(jié)果也出現(xiàn)在小球藻蛋白［24］、魚腥藻的藻藍(lán)蛋白［25］和龍須菜的藻膽蛋白［26］。楊立紅等［25］在對魚腥藻藻藍(lán)蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，純化后的蛋白比粗蛋白的抗超氧能力更高，且呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系。超氧陰離子自由基是體內(nèi)主要的活性氧，是生成有害活性氧的源頭，在細(xì)胞中通過單電子還原產(chǎn)生的O－2·，來自線粒體、微粒體、漿膜和胞漿的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)。龍須菜的藻膽蛋白具有良好的抗超氧陰離子能力，并隨著蛋白含量升高而增加［26］。

薔薇藻純化后的藻藍(lán)蛋白比粗藻藍(lán)蛋白具有更高的總抗氧化能力，且呈劑量依賴效應(yīng)。這與Estrada等［22］在對螺旋藻的抗氧化研究中得到的結(jié)果相一致。魚腥藻純蛋白的總抗氧化能力高于粗蛋白［25］，Pinero 等［23］發(fā)現(xiàn)螺旋藻藻膽蛋白中藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性最強，其抗氧化活性隨純度的增加而增大。在光照條件下，藻膽蛋白能夠產(chǎn)生自由基，而在黑暗中，則能夠清除自由基，顯示藻膽蛋白有產(chǎn)生和清除自由基的雙重功能［27］。

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