獼猴桃白蘭地專用酵母菌的選育及鑒定*

田殿梅，張良，，盧中明，，秦輝，侯長軍，霍丹群

1(重慶大學生物工程學院，重慶，400044)2(國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州，646000)

獼猴桃又名陽桃、茅梨，果實中除了含有大量VC外，還含有糖、鈣、鎂、鐵、磷、有機酸以及多種氨基酸，是人們所喜愛的特色水果。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國栽培獼猴桃面積已達4萬余公頃，年產量達到近9萬t。有關人士預測:我國現(xiàn)有的獼猴桃在全部進入盛果期后，產量會超過目前的消費需求。目前，獼猴桃的貯藏保鮮技術尚不完善，銷售方式以鮮果為主，造成大量鮮果積壓與腐爛，因此，對其進行深加工是發(fā)展的必然趨勢。在釀酒方面，由于原料供應充足，具有顯著的資源優(yōu)勢，有利于保護果農的栽培積極性，帶動地方經濟的發(fā)展。目前，我國在獼猴桃酒釀制過程中，缺乏獼猴桃酒專用菌種，使用的酵母基本是AADY活性酵母或是葡萄酒酵母，它不是獼猴桃釀酒的理想酵母，獼猴桃酒用酵母最好從成熟的獼猴桃果實上分離選育，性能可滿足發(fā)酵徹底、產香能力強、產酸能力適度、對酒的風味貢獻大等基本要求。本試驗通過富集培養(yǎng)和劃線分離源自成熟獼猴桃果皮、果汁自然發(fā)酵液中的微生物，并進行有效的分離篩選，通過穩(wěn)定性測試、發(fā)酵力測試、發(fā)酵及蒸餾結果分析，篩選出適合獼猴桃白蘭地的優(yōu)良釀酒酵母［1－4］，并通過ITS1－5.8S－ITS2 rDNA區(qū)域序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析對篩選菌株進行分子生物學鑒定［5］。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

獼猴桃，四川長青縣海沃特品種;葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限公司;TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)，Amresco;安琪酵母，安琪酵母股份有限公司。

7890 A/5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀;美國Agilent公司;BIO-RAD mylyder，PCR擴增儀;SW-CG－1C超凈工作臺，蘇凈安泰;LDZX－50KBS高壓蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

TTC下層培養(yǎng)基:葡萄糖10.1 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸膏1.5 g，酸性磷酸鉀 1.0 g，硫酸鎂 0.4 g，檸檬酸 0.27 g，瓊脂 30.0 g，水 200 mL。

TTC上層培養(yǎng)基:TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂 1.5 g，水 100 mL。

YPD培養(yǎng)基:酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉 20 g，加水至 1 000 mL。

1.2.2 酵母菌的分離

用腐爛獼猴桃的果皮及部分果肉加到新鮮獼猴桃汁中發(fā)酵后取發(fā)酵液25 mL，用無菌水稀釋至250 mL，通過梯度稀釋方法將稀釋液接種至TTC分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選出產酒精能力強的紅色菌株［6］，并通過劃線培養(yǎng)進行分離純化菌株，觀察單菌落的形態(tài)大小，將分離出的單菌落接種于YPD斜面試管中，28℃培養(yǎng)2 d，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酵母菌的初篩

采用杜氏管發(fā)酵法，將10 mL獼猴桃汁加入試管中，滅菌冷卻后加入酵母菌，在相同的培養(yǎng)條件下，測定菌株產氣能力，初步比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵能力，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。記錄產氣時間和產氣量，重復3次?；罨瘲l件:28℃條件下，10°Brix麥芽汁恒溫振蕩10 h:發(fā)酵條件:28℃條件下，獼猴桃汁靜止發(fā)酵 48 h;接種量:l×106CFU/mL［7］。

1.2.4 酵母菌的復篩

按1×106CFU/mL的接種量，將篩選出的各菌種分別接至500 mL成分調整后的獼猴桃果漿中20℃培養(yǎng)，比較各酵母發(fā)酵力，以安琪釀酒酵母為對照菌株;待發(fā)酵結束后進行初次蒸餾，蒸餾條件:過濾發(fā)酵產物，取濾液400 mL，添加蒸餾水400 mL，功率選擇600 W，截取濾液400 mL供分析檢測。按照GB15038—2005規(guī)定的方法對各酵母釀造酒液進行理化測定［8］。獼猴桃果漿成分調整方法:用葡萄糖調整糖度至18%，用CaCO3調整果漿至pH3.6，SO2添加量為75 mg/L。

1.2.5 氣相色譜-質譜分析條件

色譜柱條件:進樣口溫度250℃，起始溫度50℃，保留3 min，以 5℃/min升至 220℃，保留 30 min，載氣 He，檢測器溫度250℃。質譜條件:電離方式 EI，電離電壓70 eV，恒壓10 Pa，連接桿溫度280 ℃，進樣口溫度為 250 ℃ 。［9］

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定

將菌種接種到盛有 YPD固體培養(yǎng)基的平板中，28℃ 培養(yǎng)2～3 d后涂片，用美蘭對細胞染色后鏡檢，觀察其細胞形態(tài);將活化好的酵母在產孢子培養(yǎng)基上劃線，25℃ 培養(yǎng)3 d，鏡檢是否有子囊孢子。

1.3.2 分子生物學鑒定

1.3.2.1 基因組DAN提取

收集過夜培養(yǎng)的酵母細胞，在液氮中充分研磨后用4 mLDNA提取液溶解并轉移至1.5 mL滅菌的離心管中，加入與離心管中DNA提取液等體積的氯仿-異戊醇(V∶V=24∶1)，劇烈振蕩后 13 000 r/min離心。取上清液用等體積氯仿-異戊醇重復處理1次。加入等體積預冷的異丙醇，混勻后于－20℃下靜置15 min，13 000 r/min 離心 7 min。沉淀用 100 μL 70%無水乙醇各洗滌1次，真空抽干后加入50 μL無菌水，溶解后－20℃下保藏備用［10］。

1.3.2.2 ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列擴增

PCR擴增條件為95℃預變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共循環(huán) 35次，最后72℃延伸10 min，4℃保存，PCR產物純化后測序。反應體系(25 μL)為:模板 DNA 3 μL 引物ITS1(10 mol/L)和 ITS4(10 mol/L)各 1μL，dNTPs(2.5 mmol)1 μL ，buffer 2.5μL，Taq 酶1 μL，用滅菌的雙蒸水將體系補齊至25 μL。

1.3.2.3 克隆

對擴增的ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列進行純化(按PCR產物純化試劑盒說明進行操作)，然后與克隆質粒PUM-T載體連接(參照產品說明書)，4℃連接過夜，連接產物轉化E.coli感受態(tài)細胞后，涂于含有 Amp(100 μg/mL)、IPTG(0.5 mmol/L)，X-gal(80 μg/mL)的LB平板上，倒置培養(yǎng)過夜。用滅菌牙簽挑取孵性克隆至5 mL的LB培養(yǎng)基(含5 μL 50 μg/mL Amp)中.37℃下200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.2.4 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將培養(yǎng)24 h的菌液送至華大基因有限公司進行測序，得到菌株PCR擴增片段的原始序列。在Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫中對得到的序列進行比對;為進一步顯示供試菌株和已知酵母菌的親緣關系及系統(tǒng)地位，根據(jù)同源序列搜索結果，采用MEGA5.0軟件，Neighbour-Joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行1 000次 Bootstrap 檢驗［11］。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的初篩

在TTC顯色平板上共選取紅色較深的菌落23株，酵母菌在含有杜氏小管的試管中20℃發(fā)酵48 h產氣能達到約等于杜氏小管滿體積的酵母菌有10株，說明這些酵母菌起酵能力比較強，可能有較高的發(fā)酵度和發(fā)酵效率，將這10株酵母菌作為出發(fā)菌株進行復篩。杜氏小管產氣情況如表1所示。

表1 杜氏小管產氣情況

2.2 酵母菌的復篩

將初篩到的10株酵母菌及對照菌株安琪釀酒酵母分別接種到20°Brix的獼猴桃果漿中20℃發(fā)酵10 d，測定其殘?zhí)?、酒精度及總酸度，如?所示。

表2 酵母菌發(fā)酵性能情況

通過GC-MS［12］分析不同酵母釀造的白蘭地香氣成分得知，獼猴桃白蘭地酒中的非酒精揮發(fā)物，包括高級醇、酯類物質、揮發(fā)酸、以及醛酮類物質是主要的香氣成分。這四類物質在獼猴桃白酒中的含量比較如圖1。

圖1 各株酵母產高級醇、酯、醛酮及酸類物質能力比較

由圖1可以看出N5和N13酵母釀造的白蘭地產酯性能均較其他酵母優(yōu)秀，同時其刺激性香氣成分包括高級醇、醛酮類物質及酸類物質的含量較其他酵母釀造的白蘭地均處于較低的水平。

其中具體香氣成分中對獼猴桃白蘭地貢獻較大的主要有β-苯乙醇(PEA)、乙酸乙酯及丁酸乙酯，其中β苯乙醇(PEA)是一種帶有淡雅細膩玫瑰氣味的芳香醇;丁酸乙酯具有菠蘿芳香氣味;乙酸乙酯具有果香味。這些物質在獼猴桃白蘭地中的含量比較如圖2。

由圖2可以看出各組酵母產β-苯乙醇的能力基本處于相同的水平，而N5產乙酸乙酯及丁酸乙酯的能力明顯優(yōu)于其他酵母，其中乙酸乙酯的含量為0.094 4 g/L，丁酸乙酯的含量為0.122 0 g/L;N13酵母發(fā)酵產物中乙酸乙酯含量為0.150 g/L。

圖2 各株酵母產β-苯乙醇、丁酸乙酯及乙酸乙酯能力比較

2.3 菌株形態(tài)學觀察:

N5和N13酵母菌在PDA平板上培養(yǎng)2 d后形成的菌落呈橢圓形或卵圓形，乳白色，表面隆起，邊緣整齊，表面光滑，無光澤，質地粘稠，聞其有酒香味;菌體細胞呈卵圓形，細胞為兩端及多端出芽生殖(圖3)。

圖3 N5和N13酵母菌落形態(tài)及顯微照片

2.4 DNA提取和PCR擴增結果

以ITS1和ITS4為引物通過酵母菌特異性PCR反應:擴增得到ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列擴增產生的DNA片段為單一條帶，大小長度約為760bp，擴增產物無明顯非特異擴增現(xiàn)象，結果見圖4。

圖4 N5與N13酵母ITS1－5.8S－ITS2 rDNA的PCR擴增結果

2.5 ITS1－5.8S－ITS2 rDNA序列相似性

對兩株菌株的ITS－5.8S－ITS2序列進行分析，并將得到的序列與NCBI Gen-Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性序列搜索。比對結果顯示，這2株菌株與葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)的相似性均達到99%，利用 MEGA 5.0軟件，Neighbor Joining方法構建兩株酵母與相關菌種的ITS1－5.8S－ITS2rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1000次的相似度重復計算(圖5):結果表明，N5酵母和N13酵母均能與FR751341.1 Hanseniaspora uvarum聚在一起，與其遺傳距離最近，并且置信度均達到97%。據(jù)此可以認為菌株N5與N13均屬于Hanseniaspora uvarum有孢漢遜酵母屬。

圖5 N5和N13酵母ITS1－5.8S－ITS2 rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論

本研究從腐爛的獼猴桃果實自然發(fā)酵液中成功分離得到2株釀造性能優(yōu)良的酵母菌株N5和N13，在接種量為1×106CFU/mL、初始糖度為 18°Brix、SO2濃度為75 mg/L、初始pH值為3.6、發(fā)酵溫度為20℃時，發(fā)酵10天，經過一次蒸餾后得到的白蘭地在酒精度、乙酸乙酯及丁酸乙酯的含量方面均明顯優(yōu)于安琪酵母在相同條件下的釀造產物。經形態(tài)學和ITS1－5.8S－ITS2 rDNA分子生物學鑒定二者與葡萄汁漢遜酵母的相似度達到99%，通過構建其系統(tǒng)發(fā)育樹得知，二者與葡萄汁漢遜酵母屬于同種的置信度達到97%，據(jù)此可以認為菌株N5與N13均屬于Hanseniaspora uvarum有孢漢遜酵母屬。

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