木霉菌株TC-14的生物學(xué)特性及rDNA ITS序列測定

鄧 龍 鄧 勛 尹大川 宋瑞清*

(1.黑龍江省林科院，哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

木霉菌(Trichodermaspp.)廣泛存在于土壤及其他基質(zhì)中，生長迅速且具有極強的環(huán)境適應(yīng)能力[1]。木霉菌是世界著名的生防菌，其生防機理包括競爭作用、重寄生作用、代謝抑菌活性物質(zhì)、細胞壁降解酶以及誘導(dǎo)植物抗性等多個方面[2]。化學(xué)防治帶來的一系列環(huán)境問題日益突出，生物防治技術(shù)正日益受到重視，目前世界范圍內(nèi)已經(jīng)形成多個商品化木霉菌劑產(chǎn)品[3]，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)中的土傳病害、葉部病害的生物防治中發(fā)揮了重要的作用。

木霉菌株TC-14是經(jīng)篩選獲得的高效生防菌株。前期試驗結(jié)果表明，該菌株對林木主要病原菌包括立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、樟子松枯梢病菌(Sphaeropsissapinea)、楊樹爛皮病菌(Cytosporachrysosperma)、松爛皮病菌(Cenangiumferruginosum)等具有較強的拮抗作用，其代謝產(chǎn)物可以有效抑制病原菌菌絲的生長。在野外應(yīng)用研究中，利用木霉菌株TC-14制作的菌劑對林業(yè)苗圃的針葉苗木立枯病具有較好的生物防治效果。為進一步大規(guī)模的發(fā)酵和菌劑生產(chǎn)的需要，本文系統(tǒng)地研究了菌株TC-14的生物學(xué)特性，同時對其rDNA ITS序列進行了測定，通過分子生物學(xué)手段驗證其分類學(xué)地位。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

木霉菌株TC-14為經(jīng)室內(nèi)外篩選獲得的高效菌株，保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌株TC-14的生物學(xué)特性

(1)溫度對菌株生長的影響。菌絲測定實驗采用生長速率法(以下同)。用直徑10mm的打孔器切取培養(yǎng)好的菌落，接種于PDA平板培養(yǎng)基中心，分別置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫箱中培養(yǎng)，48h后測量菌落直徑，每個梯度設(shè)3個重復(fù)。

(2)碳源對菌株生長的影響。供試培養(yǎng)基為碳源培養(yǎng)基(配方：各種碳源20g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鉀3g，瓊脂20g，水1 000mL，pH值為6.0)。供試碳源為甘露醇、蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖。以PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)作為對照。25℃恒溫培養(yǎng)。方法同上。

(3)氮源對菌株生長的影響。供試培養(yǎng)基為氮源培養(yǎng)基(配方：各種氮源2g，葡萄糖20g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鉀3g，瓊脂20g，水1 000mL，pH值為6.0)。供試氮源為甘氨酸、硝酸鈣、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酒石酸銨、硝酸銨。以PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)作為對照。方法同上。

(4)pH值對菌株生長的影響。將培養(yǎng)基pH值調(diào)為5、6、7、8、9。用直徑10mm的無菌打孔器切取已培養(yǎng)好的木霉菌落，接種于不同pH值平板培養(yǎng)基(所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基)中心，25℃恒溫培養(yǎng)。48h測量菌落直徑，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 木霉菌株TC-14 rDNA ITS序列測定

采用CTAB法[4]提取菌絲體DNA，應(yīng)用ITS1和ITS4引物[5]進行PCR擴增(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，引物由上海生工生物公司合成。

PCR反應(yīng)體系：10X PCR buffer 5μL，dNTPS 5μL，ITS1引物5μL，ITS4引物5μL，Taq酶0.75μL，DNA模板2.5μL，ddH2O 26.75μL，總體積50μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，72℃補平10min。

將未純化PCR產(chǎn)物直接測序，對測序結(jié)果在GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進行Blast分析，確定其分類地位，使用MEGA4.0軟件，采用UPGMA法對ITS區(qū)域(ITS1+5.8S+ITS2)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株TC-14的生物學(xué)特性

(1)溫度對菌株生長的影響。菌株TC-14在試驗所設(shè)溫度范圍內(nèi)均可生長(圖1)。25℃生長最好，生長2d菌落長滿平板。菌落生長速度較快，菌絲較為旺盛；10℃生長極其緩慢，且菌落形態(tài)較為稀疏。生長的最佳溫度范圍是25～30℃。

(2)碳源對菌株生長的影響。木霉菌TC-14能夠利用的碳源比較廣泛，對供試碳源均有較高的利用率(圖2)。其中，對葡萄糖、乳糖和蔗糖利用最好，菌株在以葡萄糖、乳糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長2d，菌落直徑超過55mm。利用較差的是甘露醇。

(3)氮源對菌株生長的影響。木霉菌株TC-14能較好的利用各種有機氮源和無機氮源(圖3)。在供試氮源中，利用最佳的氮源是酒石酸銨和蛋白胨，在以酒石酸銨為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d菌落直徑達到56.1mm，利用最差的氮源是硝酸鈣。

(4)pH值對菌株生長的影響。木霉菌株TC-14在不同的pH值梯度范圍均可生長(圖4)。在pH值為7的培養(yǎng)基上生長最為旺盛，菌絲生長速率最快，且致密。培養(yǎng)2d菌落直徑達到62.5mm。隨著pH值的增加，菌株生長呈下降趨勢，在pH值為9的培養(yǎng)基中，菌絲生長緩慢，稀疏，說明木霉菌株TC-14不宜在偏堿性的環(huán)境中生長。

2.2 木霉菌株TC-14 rDNA ITS序列測定

使用引物ITS1和ITS4從木霉菌株TC-14擴增出的目的片段為582bp(圖5，圖6)，GenBank登陸號為HQ845040。

1 ggggcaatcg actcactcca acccaatgtg aacgttacca aactgttgcc tcggcgggat

61 ctctgccccg ggtgcgtcgc agccccggac caaggcgccc gccggaggac caacctaaaa

121 ctcttattgt ataccccctc gcgggttttt ttataatctg agcctttctc ggcgcctctc

181 gtaggcgttt cgaaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga

241 tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa

301 tctttgaacg cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgtcc gagcgtcatt

361 tcaaccctcg aacccctccg gggggtcggc gttggggatc ggccctccct tagcgggtgg

421 ccgtctccga aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac

481 tcgcatcggg agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc caacttctga aatgttgacc

541 tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca aa

圖6木霉菌株TC-14rDNAITS序列

從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得相似率較高、親緣關(guān)系近的物種，采用UPGMA法對ITS區(qū)域(ITS1+5.8S+ITS2)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖7)。從聚類結(jié)果可以看出，該種內(nèi)存在一定的遺傳分化，主要分化為2個類群(種)。類群(種)1包括4個菌種，其中Hypocrealixii-FJ517546、H.lixii-FR872740、H.lixii-JN179079和T.haziranum-TC-14相似率高于98%，聚成一支，驗證為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)，其有性型為Hypocrealixii。

3 結(jié)論

(1)木霉菌株TC-14最適宜的碳源為葡萄糖，最適宜的氮源為蛋白胨，最適宜培養(yǎng)溫度為25℃，適宜在偏酸性環(huán)境下生長。

(3)試驗菌株為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)。rDNA ITS序列長度為582bp，GenBank登陸號為HQ845040。

參考文獻：

[1]王斌.長枝木霉TlCC鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011,27(5):338～345.

[2]朱廷恒，邢小平，孫順娣.木霉T97菌株對幾種植物病原真菌的拮抗作用機制和溫室防治試驗[J].植物保護學(xué)報，2004,31(2)：139～144.

[3]Mausam V., Satinder K. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control[J].Biochemical Engineering Journal,2007，(37)：1～20.

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[5]White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].Academic Press,1990:315～322.

[6]郭春宣，王峰，董愛榮.粗毛纖孔菌形態(tài)學(xué)鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26(3)：142～145.