鼠曲草多糖的提取及抗氧化性的研究

陳文燕，歐曉素，鄭詩(shī)漫，林燕如

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州 521041）

潮汕民間有一傳統(tǒng)小食“鼠曲粿”，它的原料之一為鼠曲草.鼠曲草（Gnaphlium affine D.Don）別名為鼠耳、鼠耳草、香茅、黃花白艾等，系菊科鼠曲草屬植物.鼠曲草分布在我國(guó)大部分地區(qū)，來(lái)源廣泛，原料易得，具有降血脂、降血糖、降血壓、抗衰老、消炎抑菌、增強(qiáng)免疫力等多種功效[1-2].為此，筆者開(kāi)展了鼠曲草多糖的提取工藝和抗氧化活性的研究，從而為鼠曲草的全面開(kāi)發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

鼠曲草采自潮州湘橋區(qū)橋東郊區(qū)，將鼠曲草洗凈，去雜質(zhì)，置于50℃烘箱中烘干，粉碎，用石油醚回流脫脂，再用80%乙醇回流，除去單糖和低聚糖，抽濾，將其烘干裝瓶，置于干燥器中備用.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取

多糖的提取工藝流程[3-6]，將鼠曲草粉末按比例加水混合→超聲波浸提→抽濾→濃縮溶液→用高嶺土脫色→抽濾→醇沉→離心→洗滌沉淀→將沉淀配制成50 mL的溶液→用Seveage法除蛋白質(zhì)→過(guò)濾→配制成100 mL待測(cè).選取超聲波功率、超聲波時(shí)間、浸提溫度、料液比做單因素試驗(yàn)[5,7].在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)超聲波功率、料液比、浸提溫度、超聲波時(shí)間等因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平如表1所示.

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平

1.2.2 多糖的測(cè)定

多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[8,9]：以葡萄糖為標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最大吸收波長(zhǎng)為490 nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=5.13x+0.1533，R2=0.9999，式中x為葡萄糖濃度，y為吸光度.

多糖含量的測(cè)定[10]：量取2 mL樣品置于比色管中，以空白液作為對(duì)照，用硫酸-苯酚法于波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖的含量（多糖含量的計(jì)算公式：W=VCD/2000m，式中：V：浸提液體積，mL；C：從葡萄糖線性方程中求得的2 mL稀釋液中葡萄糖的濃度，mg/mL；D：稀釋倍數(shù)；m：鼠曲草的質(zhì)量，g）.

1.2.3 鼠曲草多糖的抗氧化性試驗(yàn)

羥自由基的清除，方法參照李婕姝[11]和李玲[12]并加以改進(jìn).在10 mL比色管中依次加入0.75 mmol/L的FeSO4溶液3 mL，9 mmol/L的水楊酸溶液3 mL，1 mmol/L的H2O2溶液3 mL，加蒸餾水定容至10 mL.搖勻，放入37℃恒溫水浴槽中恒溫15 min后取出，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度為A0.按上述體系，分別加入待測(cè)液為2 mg/mL的鼠曲草多糖溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，蒸餾水定容至10 mL，搖勻，37℃水浴中繼續(xù)恒溫15 min，取出測(cè)其吸光度為AX.在10 ml比色管中依次加入0.75 mmol/L的FeSO4溶液3 mL，9 mmol/L的水楊酸溶液3 mL，1 mmol/L的H2O2溶液3 ml，再分別加入2 mg/mL的檸檬酸溶液、抗壞血酸溶液和鼠曲草多糖溶液各為0.2 mL，用蒸餾水定容至10 mL，混勻，37℃水浴加熱15 min后測(cè)其吸光度，比較檸檬酸、抗壞血酸和鼠曲草多糖溶液對(duì)·OH的清除能力.待測(cè)液對(duì)羥自由基·OH清除率計(jì)算公式為：·OH清除率（%）＝(A0-Ax)/A0×100%.式中A0是不加多糖溶液的吸光度；Ax是加入多糖溶液后的吸光度.

超氧陰離子的清除，具體方法參照李婕姝[11]和李玲[12]并加以改進(jìn).往10 mL比色管中加入pH8.20的磷酸緩沖液5 mL，分別加入2 mg/mL的鼠曲草多糖溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL（不加待測(cè)液為空白對(duì)照）.再各加入2 mmol/mL的鄰苯三酚1 mL和緩沖溶液使其總體積達(dá)到9 mL，并以蒸餾水作參比，然后立即混勻，再在325 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)325，每隔30 s測(cè)一次直反應(yīng)啟動(dòng)后的第6 min，把所得的數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A322值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到直線斜率為反應(yīng)速率V空、V樣.參照上述體系，往10 mL比色管中加入pH為8.20的磷酸緩沖液5 mL，加入濃度為2 mg/mL的檸檬酸溶液和鼠曲草多糖溶液，加入2 mmol/mL的鄰苯三酚1 mL，加入緩沖溶液使體系總體積達(dá)到9 mL，并以蒸餾水作參比，然后立即混勻，在325 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)325，每隔30 s測(cè)一次直到反應(yīng)啟動(dòng)后的第6 min，把所得的數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A322值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到直線斜率為反應(yīng)速率V空、V樣.以檸檬酸對(duì)·的清除作對(duì)比分析.超氧陰離子的清除率按下式計(jì)算：O-2·清除率（%）=（V空-V樣）/V空×100%.式中：V空是不加多糖溶液的反應(yīng)速率；V樣是加入多糖溶液的反應(yīng)速率.

其中：rj為第j個(gè)反應(yīng)的反應(yīng)速率，mol/(m3·s)；ε為空隙率系數(shù)；C為氣體濃度，mol/m3；t為時(shí)間，s；k0,j為指前因子，mol(1-a)/(m3(1-a)·s)，a為動(dòng)力學(xué)方程中甲烷濃度的指數(shù)，數(shù)值由試驗(yàn)確定；Ej為第j個(gè)反應(yīng)的活化能，J/mol；R為氣體常數(shù)，J/(mol·K)；T為溫度，K；aj為濃度項(xiàng)的指數(shù)。圖3a、圖3b的反應(yīng)氣體為CH4，圖3c的反應(yīng)氣體為CO。根據(jù)試驗(yàn)預(yù)估的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件下鼠曲草多糖的提取

2.1.1 超聲波功率

超聲波功率不同，其他條件相同（料液比1∶40，溫度50℃，超聲波時(shí)間20 min，浸提1次）.由圖1可知，鼠曲草多糖的提取效率先是隨著超聲波功率的增加而增大，當(dāng)功率為350 W時(shí)多糖含量達(dá)到最大值.但當(dāng)功率大于350 W后，多糖提取率開(kāi)始降低，這可能是由于超聲波功率過(guò)高引起多糖結(jié)構(gòu)的變化，甚至使多糖降解，導(dǎo)致多糖提取量減少.因此，鼠曲草多糖提取時(shí)最佳超聲波功率應(yīng)該是300～400 W之間.

2.1.2 超聲波時(shí)間

超聲波時(shí)間不同，其他條件相同（料液比1∶40，溫度50℃，超聲波功率350 W，浸提1次）.由圖2可知，當(dāng)超聲波浸提30 min時(shí)多糖的提取效率是最高的.浸提時(shí)間小于30 min時(shí)，多糖提取不充分，而浸提時(shí)間大于30 min，則出現(xiàn)隨著浸提時(shí)間延長(zhǎng)效率減低的趨勢(shì).因此，超聲波時(shí)間選在20～40 min之間效果最好.

2.1.3 浸提溫度

浸提溫度不同，其他條件相同（料液比1∶40，超聲波時(shí)間30 min，超聲波功率350 W，浸提1次）.由圖3可知，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，多糖含量最高.當(dāng)溫度小于50℃時(shí)，因?yàn)槠錅囟容^低，多糖未能充分析出，所以隨著溫度的升高提取液中多糖含量逐漸增加.當(dāng)提取溫度超過(guò)55℃時(shí)，隨著溫度上升，多糖提取效率反而下降，這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致多糖被降解或破壞，故溫度選在45～55℃之間效果最好.

2.1.4 料液比

料液比不同，其他條件相同（溫度50℃，超聲波功率350 W，超聲波浸提時(shí)間30 min，浸提1次）.鼠曲草質(zhì)量為1 g，由圖4可知，當(dāng)料液比為1∶60時(shí)，多糖含量達(dá)到最高.在料液比為1∶40至1∶60時(shí)，鼠曲草的多糖含量增長(zhǎng)比較快，從1∶60至1∶80，多糖含量下降較大，到了1∶80時(shí)，多糖含量變?yōu)?.31 mg/g.提取多糖時(shí)料液比太小，提取不完全，料液比太大，濃縮時(shí)間過(guò)久，多糖溶液受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖大部分損失，多糖含量降低.因此，鼠曲草多糖提取的最佳料液比應(yīng)該在1∶50～1∶70之間效果最好.

2.1.5 提取條件的正交優(yōu)化

圖1 不同超聲波功率對(duì)多糖含量的影響

圖2 不同超聲波時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

圖3 不同浸提溫度對(duì)多糖含量的影響

選擇超聲波功率、料液比、浸提溫度、超聲波時(shí)間這四個(gè)因素，選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，以多糖含量為指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝.因時(shí)間和濃縮成本的關(guān)系，各只浸提一次.由表2可知，根據(jù)極差R分析，多糖提取條件因素的主次順序分別是料液比＞超聲波時(shí)間＞超聲波功率＞浸提溫度，超聲波提取鼠曲草多糖的最佳條件是A3B3C3D2，即料液比1∶70、超聲波時(shí)間為30 min、超聲波功率為400 W、浸提溫度為55℃.由于該組合未出現(xiàn)在試驗(yàn)中，需要測(cè)定該條件下鼠曲草多糖的含量.經(jīng)測(cè)定，鼠曲草在該條件下的多糖含量達(dá)到11.67 mg/g，高于正交試驗(yàn)表中任一組合的多糖含量，說(shuō)明正交試驗(yàn)確定的最佳超聲波萃取條件是合理的.

圖4 料液比不同對(duì)多糖含量的影響

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 鼠曲草多糖的抗氧化性

2.2.1 對(duì)羥自由基的清除能力

由圖5可知，在鼠曲草多糖添加量為0.4～2.0 mg范圍內(nèi)，隨著鼠曲草多糖添加量的增加，清除羥自由基的能力逐漸增強(qiáng).當(dāng)鼠曲草多糖添加量為2.0 mg時(shí)，其清除率為42.59%，說(shuō)明適當(dāng)增加鼠曲草多糖的量有利于提高對(duì)羥自由基的清除效果.由圖6可知，在相同鼠曲草多糖添加量下，幾種抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除效果為檸檬酸（52.81%）＞抗壞血酸（33.94%）＞鼠曲草多糖（32.30%）.鼠曲草多糖的清除效果與抗壞血酸的相近，說(shuō)明鼠曲草多糖對(duì)羥自由基的清除有一定的效果.

2.2.2 對(duì)超氧陰離子的清除能力

由圖7可知，在鼠曲草多糖添加量為0.4-2.0 mg范圍內(nèi)，隨著鼠曲草多糖添加量的增加，清除超氧陰離子的作用逐漸增強(qiáng).當(dāng)添加量為2.0 mg時(shí)，其清除率為28.76%，說(shuō)明適當(dāng)增加鼠曲草多糖添加量有利于提高對(duì)超氧陰離子的清除效果.由圖7可知，在相同添加量下，檸檬酸對(duì)超氧陰離子的清除率小于鼠曲草多糖.鼠曲草多糖對(duì)超氧陰離子的清除率為31.71%，檸檬酸的清除率為20.54%，說(shuō)明鼠曲草多糖對(duì)超氧陰離子的清除效果明顯.

圖5 鼠曲草多糖對(duì)羥自由基的清除作用

圖6 不同抗氧化劑對(duì)羥自由基及超氧陰離子的清除效果

圖7 鼠曲草多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響鼠曲草多糖提取效率的超聲波功率、料液比、浸提溫度、超聲波時(shí)間等因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明料液比1∶70，超聲波功率400 W，超聲波時(shí)間30 min，浸提溫度55℃為鼠曲草多糖的最佳提取工藝.在此條件下，鼠曲草的多糖含量是11.67 mg/g.同時(shí)，此次實(shí)驗(yàn)還對(duì)鼠曲草多糖的抗氧化性進(jìn)行研究，結(jié)果表明鼠曲草多糖具有較好的清除羥自由基以及超氧陰離子的能力.該研究為鼠曲草這一植物資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ).

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