苦參堿誘導宮頸癌Hela細胞的凋亡作用＊

西電集團醫(yī)院（西安710077） 王 麗 蘇寶山 吳 靜

苦參堿（Mat）是從我國傳統(tǒng)中藥苦參中提取的一種生物活性成分，具有廣泛的藥理學作用［1］。Mat有抗心率失常，抗炎，抗病毒，調(diào)節(jié)免疫，抗變態(tài)反應等作用，現(xiàn)已被廣泛應用于臨床各科［2，3］。目前大量的體內(nèi)外研究證實，Mat可明顯抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其向正常分化和凋亡，研究較多的是Mat對肝癌細胞及白血病細胞的作用，但對宮頸癌Hela細胞的研究尚少，本實驗旨在研究Mat對宮頸癌Hela細胞的增殖及凋亡的影響，為Mat應用于宮頸癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 人宮頸癌Hela細胞株：由西安交通大學醫(yī)學院癌癥研究所惠贈。

1.2 主要試劑（如無特指均為國產(chǎn)分析純試劑）：Mat純度為98%，購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCO產(chǎn)品；小牛血清（BCS）杭州四季青生物工程材料研究所；MTT（四甲基偶氮唑鹽）和碘化丙啶（PI）為美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器和設備：CO2培養(yǎng)箱（SHEL-LAB型，美國），超凈工作臺，倒置光學顯微鏡（OLYMPUSCK40型，日本），酶標比色儀（450型，美國Bio-Rad公司），流式細胞儀（Coulter Epics XL）。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)：將宮頸癌Hela細胞用含10%小牛血清（BCS），青霉素100U／ml，鏈霉素100ug／ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、含5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育傳代培養(yǎng)，每天觀察細胞。

2.2 顯微鏡下觀察不同濃度Mat作用宮頸癌Hela細胞后細胞形態(tài)學的變化。

2.3 MTT法檢測Mat對Hela細胞的增殖抑制影響：收集對數(shù)增殖期細胞，培養(yǎng)液配成單細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×104／ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl。將Hela細胞分為Mat組及對照組分別加藥。Mat組的終濃度依次為：0.5mg／ml、1.0mg／ml、1.5mg／ml、2.0mg／ml。每個濃度均設4個平行復孔，每孔總體積200μl，以不加藥組為對照組（細胞懸液100μl、培養(yǎng)液100μl）。另設調(diào)零孔，只加培養(yǎng)液200μl。共同于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入 MTT（5mg／ml）20μl，繼續(xù)于上述環(huán)境中培養(yǎng)4h后棄去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）各150μl，微型震蕩混合儀震蕩15min，使結(jié)晶物完全溶解，酶聯(lián)免疫儀上選擇波長490nm，以調(diào)零孔調(diào)零后，測定每孔吸光度值（OD值）。

重復以上實驗3次，按下列公式計算細胞生長抑制率：

細胞生長抑制率（%）＝［1-（實驗組OD490均值／對照組OD490均值）］×100%

2.4 Annexin V FITC／PI雙標染色，流式細胞儀測定Hela細胞凋亡率：將不同濃度Mat作用不同時間的宮頸癌Hela細胞EDTA消化、PBS洗滌離心2次，緩沖液重懸細胞，吸取100μl細胞懸液于流式管中，加入5μl Annexin V FITC、10μl PI，混勻后避光孵育15min，在加入400μlPBS，流式細胞儀分析細胞凋亡。

結(jié) 果

1 各組細胞培養(yǎng)結(jié)果 苦參堿各處理組細胞培養(yǎng)72h后，光鏡下均見貼壁細胞脫落，變圓，體積縮小，懸浮于培養(yǎng)液中，胞質(zhì)內(nèi)見較多顆粒，色深，呈深褐色；胞核顏色加深，折光性增強。而且隨著苦參堿濃度增加，培養(yǎng)液中脫落死亡細胞數(shù)增加。對照組細胞脫落甚少，背景干凈，Hela細胞呈多角形，貼壁生長良好，胞質(zhì)飽滿，相鄰細胞生長已連接成片（見圖1、圖2）。

2 MTT增殖抑制實驗結(jié)果 不同濃度Mat作用于Hela細胞不同時間，均能不同程度抑制其生長，并且隨Mat濃度增加及培養(yǎng)時間延長抑制率增強，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性；不同濃度組，作用不同時間 Mat對Hela細胞的抑制率在3.2%～44.8%之間，以2.0mg／mlMat作用于Hela細胞72h抑制作用最強，抑制率為44.8%，不同濃度Mat、作用不同時間，與對照組相比，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示差異均有顯著性﹙P＜0.05﹚。測得OD值見表1，計算所得不同濃度組抑制率見表2及圖3。

圖1 正常生長的Hela cells（DABx400）

圖2 苦參堿作用后的Hela cells（DABx400）

圖3 苦參堿抑制Hela細胞生長曲線

表1 Mat對宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用（±s，n＝4）

表1 Mat對宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用（±s，n＝4）

Mat（mg／ml）OD 24h 48h 72h 0.0 0.680±0.002 0.685±0.001 0.692±0.004 0.5 0.658±0.005 0.655±0.007 0.632±0.005 1.0 0.603±0.001 0.583±0.005 0.547±0.001 1.5 0.529±0.002 0.508±0.003 0.470±0.004 2.0 0.458±0.004 0.401±0.002 0.382±0.002

表2 不同濃度Mat對宮頸癌Hela細胞的抑制率

3 流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡率 Hela細胞經(jīng)不同濃度苦參堿作用24、48、72h后，細胞凋亡率隨苦參堿濃度增加及作用時間的延長而明顯升高，各濃度組及作用時間段與對照組相比均有顯著差異性﹙P＜0.05，見表3）。

表3 不同濃度Mat誘導宮頸癌HeLa細胞的凋亡率

討 論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制復雜，至今尚不明確。對宮頸癌早期診斷、早期治療達到了前所未有的水平。但是，對中晚期宮頸癌的綜合治療，5年存活率及生活質(zhì)量仍較低。人們早已發(fā)現(xiàn)從中草藥及天然植物中提取的活性成分有抑制腫瘤細胞的增殖，殺傷腫瘤細胞的作用，如臨床上常用的抗癌藥物如長春新堿、紫杉醇等都是從天然中草藥中提取成分，跟蹤分離篩選、結(jié)構(gòu)改造與化學合成的，多年來的臨床應用表明，它們的抗癌療效顯著，現(xiàn)已成為臨床抗癌的常用藥，廣泛用于各種腫瘤的化療。

苦參是傳統(tǒng)中藥之一，又名野槐、山槐、地參等，從苦參中可分離出23種生物堿，其中主要是Mat和氧化苦參堿［4］，其中Mat的藥理作用廣泛，隨分子生物學的發(fā)展，目前對Mat抗腫瘤研究已經(jīng)成為中藥抗癌研究之熱點，大量研究已經(jīng)證明Mat有抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡、分化等作用，同時具有減輕放化、療毒副作用、升高白細胞、提高機體免疫力，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥（MDR），增加化療藥對腫瘤細胞的敏感性［5，6］。凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡，屬于細胞生理性死亡，通過細胞凋亡，機體能及時清除過多的、受損的或惡變細胞，維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。人們越來越認識到凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關。

本實驗用不同濃度Mat作用于體外培養(yǎng)的宮頸癌Hela細胞24h、48h、72h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Hela細胞由原來的多邊形，貼壁、形態(tài)飽滿，連接成片變成體積縮小、變圓，脫落懸浮于培養(yǎng)液中，胞質(zhì)、胞核顏色加深；采用MTT法測定Mat對宮頸癌Hela細胞增殖抑制作用；流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的Mat、作用不同時間對宮頸癌Hela細胞的增殖均有抑制作用，可誘導Hela細胞凋亡，說明Mat對宮頸癌Hela細胞有抑制作用，可作為中晚期宮頸癌的治療的輔助用藥。

近年來對凋亡機制研究的不斷深入，使得我們利用凋亡機制治療腫瘤成為可能。從凋亡途徑機制中尋找治療腫瘤靶點，現(xiàn)已有報道，能否應用于臨床，還有待進一步研究。

［1］肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2002，555-561.

［2］張寶恒，王年生，李學軍，等.苦參堿的抗心率失常作用［J］.中國藥理學報，1990，11（3）：253-257.

［3］陳小文，樊國強.苦參堿注射液治療慢性乙型肝炎效果分析［J］.南華大學學報（醫(yī)學版），2006，34（4）：132-134.

［4］馬方勵，程 怡.苦參堿多種制劑的藥效學研究進展［J］.中成藥，2004，26（5）：420-422.

［5］李旭芬，張?zhí)K展，鄭 樹，等.苦參堿對K562及多藥耐藥細胞K562／vin的細胞生物學影響［J］.中國病理生理雜志，2002，18（10）：1233.

［6］李文瑜，李舜華，崔克義，等.苦參堿逆轉(zhuǎn)的白血病多藥耐藥細胞系K562／AO2對柔紅霉素耐藥性的研究［J］.中國病理生理學雜志，1998，14（5）：521.