鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠痛閾的影響

李張軍 方志源 曾因明 文先杰

近年來，T型鈣通道在神經(jīng)病理性疼痛中的作用受到人們普遍關(guān)注，我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射T型鈣通道阻斷劑米貝地爾能使慢性坐骨神經(jīng)松結(jié)扎大鼠痛閾的升高［1］，但是T型鈣通道各個(gè)亞型在神經(jīng)病理性疼痛中的作用目前尚無定論。Cav3.3是T型鈣通道的一種亞型，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠背根節(jié)慢性壓迫痛模型，應(yīng)用行為學(xué)觀察的方法，探討Cav3.3亞型在神經(jīng)病理痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 反義寡聚核苷酸以大鼠Cav3基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)，由上海生工合成［2］，序列如下:Cav3.3反義寡聚核苷酸5'-GCT GAG GGC GGC TTG TGT TT-3'，錯(cuò)義寡聚核苷酸作為反義寡聚核苷酸處理的對(duì)照組，序列如下:5'-TAC TGT ACT TGC GAG GCC AC-3'，使用前用生理鹽水稀釋?？笴av3.3抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG和DAB試劑盒購自北京中山公司。von Frey纖維絲和熱痛刺激儀BME-410A分別購自美國Stolting公司和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重250～280 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括32只大鼠，隨機(jī)分為4組(n=8)，即CCD+NS組:鞘內(nèi)注射生理鹽水;CCD+Cav3.3-AS組:鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸;CCD+Cav3.3-MM組:鞘內(nèi)注射Cav3.3錯(cuò)義寡聚核苷酸;sham+NS組:鞘內(nèi)注射生理鹽水。各組大鼠在鞘內(nèi)置管成功后5 d行CCD手術(shù)或sham手術(shù)，術(shù)后第1天起，連續(xù)4 d每天兩次，鞘內(nèi)分別注射12.5 μg，容積均為10 μl的反義、錯(cuò)義寡聚核苷酸或10 μl生理鹽水。分子生物學(xué)western blot實(shí)驗(yàn)每組4只(n=4)。

1.3 CCD模型的建立 參照胡三覺等［3］方法。SD大鼠在1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后，沿 L4～6棘突右側(cè)切皮，分離脊椎右側(cè)肌肉，暴露L4～6橫突及其間的椎間孔，用彎成直角的長4 mm，直徑0.7 mm的鋼棒，以與背部正中線成30度以及與脊柱側(cè)面水平線成10度向頭背端插入L4和L5椎間孔(深度約3～4 mm)。假手術(shù)組(sham)僅暴露L4、L5橫突和椎間孔，不插入鋼棒。

1.4 鞘內(nèi)置管 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg麻醉，采用Yaksh法［4］，行鞘內(nèi)置管術(shù)，大鼠清醒24 h后觀察其活動(dòng)情況，剔除出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙的大鼠不用。術(shù)后第3天用2%利多卡因10 μ l經(jīng)導(dǎo)管注射來判斷導(dǎo)管的位置，如注射后30 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹說明導(dǎo)管位置正確。5 d后即可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)每次給藥后用10 μl生理鹽水沖洗PE管。

1.5 行為學(xué)測定 用von Frey細(xì)絲測定大鼠的機(jī)械性縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，用熱輻射法測定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。各組大鼠在手術(shù)前兩天測定基礎(chǔ)痛閾及手術(shù)后1至14 dMWT和TWL。

1.5.1 MWT的測定 用Von Frey纖維絲以u(píng)p-down法推算50%縮足閾值［5］:測定首先從2 g開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激;如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測定4次。

1.5.2 TWL的測定 應(yīng)用熱刺激儀照射大鼠足底，記錄從照射開始至出現(xiàn)足逃避反射的時(shí)間(s)，此即為熱刺激縮足潛伏期;重復(fù)測量3次，取其平均值作為熱刺激縮足潛伏期并作為定量指標(biāo)［6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析和Excel軟件制圖，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用多因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠熱痛閾的影響 除SHAM組外各組大鼠的熱痛閾在術(shù)后第1 d均降低，CCD+Cav3.3-AS組熱痛閾在術(shù)后第3～5 d(P＜0.01)明顯高于CCD+NS組。直到術(shù)后第10 d CCD+Cav3.3-AS組大鼠才形成與NS組相似的熱痛敏。Cav3.3-MM組大鼠熱痛敏的形成與NS組無差別(P＞0.05)。(見表1)。

2.2 鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠機(jī)械痛閾的影響 除SHAM組外各組大鼠在術(shù)后1 d就表現(xiàn)為明顯的觸誘發(fā)痛，CCD+Cav3.3-AS組大鼠在術(shù)后第3 d雖然機(jī)械痛閾也明顯降低，但比NS組明顯要高(P＜0.01)，直到術(shù)后第10 d，Cav3.3-AS組大鼠才形成與NS組一樣穩(wěn)定的機(jī)械痛敏(P＞0.05)，Cav3.3-MM組大鼠機(jī)械痛敏的形成與NS組無差別(P＞0.05)。(見表2)。

表1 鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠熱痛閾的影響( ± s，n=8)

表1 鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠熱痛閾的影響( ± s，n=8)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01 VS CCD+NS組.

組別TWL(s)術(shù)前 術(shù)后1 術(shù)后3 術(shù)后5 術(shù)后7 術(shù)后10 術(shù)后14 CCD+NS 20.1±2.2 15.0±3.2 10.4±3.7 9.8±1.2 10.3±1.3 10.2±2.6 11.4±2.4 CCD+AS 20.1±2.3 16.5±2.0 16.9±2.2＊＊ 15.7±3.2＊＊ 13.1±2.5* 10.8±1.7 11.8±0.5 CCD+MM 19.6±0.9 16.2±2.8 11.4±3.0 9.8±2.6 10.3±2.0 10.6±2.0 10.4±1.7 Sham+NS 20.2±2.3 19.4±2.4 20.1±1.2 20.6±2.419.6±2.7 19.4±2.0 18.6±1.8

表2 鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠機(jī)械痛閾的影響(±s，n=8)

表2 鞘內(nèi)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸對(duì)CCD大鼠機(jī)械痛閾的影響(±s，n=8)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01 VS CCD+NS組

組別MWT(g)術(shù)前 術(shù)后1 術(shù)后3 術(shù)后5 術(shù)后7 術(shù)后10 術(shù)后14 CCD+NS 14.1±1.9 4.4±0.5 4.0±2.1 2.9±1.2 4.5±0.5 3.5±1.1 3.4±1.2 CCD+AS 13.8±2.3 4.4±1.0 7.7±3.4＊＊ 7.7±2.1＊＊ 6.1±1.7* 4.0±1.3 5.4±1.8 CCD+MM 14.8±0.5 4.2±0.6 4.4±1.0 4.3±0.6 4.4±1.4 3.9±0.9 4.0±1.6 Sham+NS 15.0±0.0 13.8±2.3 12.8±3.1 13.1±1.913.4±1.6 13.1±1.8 13.4±1.9

3 討論

外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或功能紊亂引起神經(jīng)病理性痛，表現(xiàn)為自發(fā)痛、痛覺過敏和觸誘發(fā)痛。T型鈣通道屬于低電壓依賴性鈣通道，具有快速失活、緩慢關(guān)閉的特點(diǎn)，對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性有重要作用。脊髓背角傷害感受性神經(jīng)元的敏感化(中樞敏化)是引起病理性疼痛慢性痛覺過敏的重要原因之一。研究表明脊髓T型鈣通道與脊髓背角神經(jīng)原的長時(shí)程增強(qiáng)有關(guān)，參與中樞敏感化的形成［7］。

T型鈣通道有三種亞型，在不同的組織中有不同亞型的T型鈣通道的表達(dá)。用Northern blot方法對(duì)T型鈣通道的mRNA的表達(dá)的研究表明，Cav3.1 mRNA主要在人腦表達(dá)，在卵巢，胎盤和心臟中以及胎兒的腎臟和肺組織中也有表達(dá)。Cav3.2 mRNA主要在腎臟和肝臟中表達(dá)，同時(shí)在心臟，腦組織，脊髓、胰腺，胎盤，肺以及骨骼肌和腎上腺皮質(zhì)中都有表達(dá)。Cav3.3 mRNA幾乎僅僅表達(dá)在腦和脊髓組織中，在外周組織中僅腎上腺皮質(zhì)和甲狀腺有表達(dá)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，許多腦區(qū)同時(shí)表達(dá)多種亞型的T型鈣通道，如嗅腦顆粒細(xì)胞和海馬錐體細(xì)胞都同時(shí)表達(dá)上述3種亞型［8］。背根節(jié)神經(jīng)原主要表達(dá)Cav3.2和Cav3.3，并且僅限于那些小的或中等大小的神經(jīng)原中才有表達(dá)［9］。不同亞型的T型鈣通道表達(dá)可能有不同的作用，有作者認(rèn)為［10］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中 Cav3.2和Cav3.3具有致痛作用，而Cav3.1則具有鎮(zhèn)痛作用。

T型鈣通道通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、P物質(zhì)和鈣基因相關(guān)肽的釋放，參與中樞敏感化和緊發(fā)條windup現(xiàn)象的形成。由于它在接近靜息膜電位下就可以活化，使得鈣離子在靜息狀態(tài)下或閾下電位就可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，增加神經(jīng)元的興奮性，產(chǎn)生閾下膜電位，導(dǎo)致鈉依賴性動(dòng)作電位的形成，在疼痛信號(hào)傳遞中有啟動(dòng)作用。

早期由于缺少選擇性阻斷劑等藥理學(xué)工具，T型鈣通道的生理特征、作用到目前為止還是知之甚少，隨著分子生物學(xué)和電生理研究的進(jìn)步，對(duì)T型鈣通道在生理病理下的功能和結(jié)構(gòu)的研究日益增多。近年來，神經(jīng)系統(tǒng)的T型鈣通道與疼痛關(guān)系的研究引起人們的重視，Ahmet等［11］發(fā)現(xiàn)T型鈣通道參與嗎啡耐藥，嗎啡依賴和嗎啡戒斷綜合征的形成，并且鞘內(nèi)注射T型鈣通道選擇性抑制劑米貝地爾能增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛作用。Dogrul［12］給部分脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠腹腔內(nèi)或感受區(qū)局部注射米貝地爾能明顯減輕大鼠的痛敏。雖然米貝地爾對(duì)T型鈣通道的選擇性較強(qiáng)，但大劑量時(shí)也可以阻斷其它離子通道，包括N型和R型鈣通道，而N型和R型鈣通道已被證明和病理性疼痛有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用鞘內(nèi)注射Cav3.3T型鈣通道反義寡聚核苷酸，由于其能特異性與靶mRNA結(jié)合，從而空間占據(jù)并阻斷mRNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少蛋白質(zhì)的表達(dá)，具有較強(qiáng)特異性，因此我們選擇直接鞘內(nèi)給藥的方法，使其在脊髓表層的濃度相對(duì)較高，而達(dá)到最佳效率并減少由于靜脈或者其他給藥方式所造成內(nèi)生核酶的降解。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用慢性背根節(jié)壓迫模型，其產(chǎn)生的神經(jīng)痛同臨床上腰椎間盤突出、椎管狹窄等慢性痛極為相似，是研究慢性痛的常用模型。大鼠在CCD手術(shù)后1 d開始表現(xiàn)為明顯的痛敏，并且持續(xù)穩(wěn)定的存在，鞘內(nèi)連續(xù)注射Cav3.3反義寡聚核苷酸(每天兩次，連續(xù)4 d)能延緩CCD大鼠痛敏的形成，直到CCD手術(shù)后10 d，反義寡聚核苷酸組大鼠才與生理鹽水組產(chǎn)生同樣的痛敏，而Cav3.3錯(cuò)義核苷酸組與生理鹽水組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示脊髓Cav3.3參與CCD大鼠神經(jīng)病理痛的形成。

可見，脊髓Cav3.3亞型在神經(jīng)病理性疼痛的形成和維持中可能具有重要作用，抑制脊髓Cav3.3基因的表達(dá)具有疼痛治療作用。因此，開發(fā)有臨床應(yīng)用價(jià)值的選擇性抑制Cav3.3表達(dá)的藥物有可能成為慢性疼痛治療的一個(gè)方向。

［1］陳志新，文先杰，曾因明，等.鞘內(nèi)和側(cè)腦室內(nèi)注射米貝地爾對(duì)慢性坐骨神經(jīng)松結(jié)扎大鼠機(jī)痛閾的影響.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(5):571-575.

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