犬α-干擾素蛋白原核表達及條件優(yōu)化

李桂偉 周慶民 樊興冬 馮萬宇 秦 博 高俊峰

（黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，齊齊哈爾 161006）

隨著生活水平的日益提高，犬在人類的生活中占據(jù)越來越重要的地位，如作為寵物、警犬、搜救犬等。但是，犬類的各種病毒性疾病嚴重危害著犬類的健康和生存，也影響著我國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展。為防止不同原因造成的免疫程序失敗，犬類病毒病的預防和治療顯得尤為重要。因此，臨床上迫切需要安全、有效、副作用少的干擾素制劑。

干擾素（IFN）是一類能誘導動物細胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細胞因子，具有阻止病毒繁殖、調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)的生物學功能，是當今應(yīng)用前景最為廣闊的重要生物制劑之一[1，2]。IFN按其細胞來源可分為α、β及γ3種類型。其中，IFN-α是由能在脊椎動物各種類型的細胞中增殖的病毒誘導白細胞產(chǎn)生的，主要活性是抗病毒[3-5]。因此，本試驗采用犬的肝臟組織擴增干擾素基因，并進一步篩選出高效表達干擾素蛋白的原核表達系統(tǒng)，為犬α-干擾素的體外大量表達提供了依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物組織、菌種及質(zhì)粒

犬肝臟由齊齊哈爾市警犬基地提供；pBV220載體由本實驗室保存；大腸桿菌E. coli DH5α、BL21、Rosetta由本研究室制備保存。

1.1.2 主要試劑

PremixTaq DNA聚合酶；DNA makerDL2000；T4 DNA連接酶；限制性內(nèi)切酶EcoRI、SalI等購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸栽金ㄌ旖颍┥锛夹g(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中發(fā)表的犬α-干擾素基因（EF990625）去掉信號肽后設(shè)計1對引物，引入EcoRI、SalI酶切位點。引物由上海生物工程有限公司合成，序列如下：上游引物序列：5-'ATAGAATTCAGACCTGCCCGACGCC-3’，下游引物序列：5-'TACGTCGAC TCATTTCCT CCTCCTGATTCT -3 ‘

1.3 試驗方法

1.3.1 犬肝臟組織基因組的提取

將肝臟研磨成勻漿，用滅菌生理鹽水稀釋。參照V-gene DNA提取試劑盒說明書方法提取肝組織DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 犬肝臟細胞基因的擴增

以提取的肝組織DNA為模板進行PCR擴增，在50μL PCR擴增體系中加入PremixTaq酶2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板10μL、補去離子水36μL，混勻瞬時離心后進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：95℃預變性5min后進入PCR循環(huán)，94℃變性1min，56℃退火1min20s，72℃延伸2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。0.8%瓊脂糖膠凝電泳觀察PCR擴增結(jié)果。

1.3.3 犬α-干擾素基因的克隆及轉(zhuǎn)化

參照DNA凝膠回收試劑盒說明書，回收特異的DNA條帶。將回收純化的PCR產(chǎn)物與pBV220載體分別經(jīng)酶切后進行連接，轉(zhuǎn)化DH-5α、BL21、Rosetta感受態(tài)細胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落接種含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。用質(zhì)粒快速提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒用PCR和EcoRⅠ、SalI進行酶切及測序鑒定，確定為犬α-干擾素基因序列。

1.3.4 犬α-干擾素蛋白表達及條件優(yōu)化

1.3.4.1 干擾素-α蛋白的原核表達

挑取單個菌落接種于含50μg/mLAmp+的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。同時，設(shè)置未連接目的基因的空載體轉(zhuǎn)化的DH-5α、BL21、Rosetta作為對照組。取上述過夜培養(yǎng)物以1%的比例接種于新鮮含50μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，當OD600至0.4～0.6時，放到42℃恒溫水浴中熱激并繼續(xù)培養(yǎng)，誘導表達。

1.3.4.2 干擾素-α蛋白的原核表達條件優(yōu)化

表達時間優(yōu)化：將DH-5α、BL21、Rosetta 3種含pBV220-CaIFN-α的陽性工程菌以1‰量分別接入液體LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩過夜，以1%量接入液體LB培養(yǎng)基中30℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，當OD600約等于0.4-0.6 時，快速變溫至42℃，誘導表達6 h。誘導后每小時分別留取樣品。同時設(shè)誘導前和空載體對照組。根據(jù)誘導時間的不同確定各宿主菌的最佳表達時間。

宿主菌優(yōu)化：取DH-5α、BL21、Rosetta 3種宿主菌最優(yōu)表達時間做SDS-PAGE，并比較各宿主菌的表達量，確定最佳宿主菌。

通過誘導時間及表達宿主菌的不同，確定最佳表達條件。采用SDS-PAGE 電泳鑒定表達產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 犬α-干擾素基因PCR擴增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

犬α-干擾素基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約520 bp處可見特異性DNA條帶，大小與預期相符（如圖1所示）。

2.2 陽性重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

取陽性重組質(zhì)粒pBV220-CaIFN-α分別用PCR鑒定，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進行單雙酶切鑒定，雙酶切獲得2個片斷，分別為約3 660 bp的載體片斷和約520 bp的CaIFN-α基因。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ進行單酶切，獲得約4 200 bp片斷，結(jié)果與預期帶大小相符（如圖2所示）。

2.3 干擾素-α基因的測序結(jié)果

干擾素-α基因的測序結(jié)果與預期結(jié)果相符。推導氨基酸序列，通過在線軟件分析，試驗獲得的犬干擾素-α基因與天然犬干擾素-α的同源性為99.9%。

2.4 干擾素-α的表達及條件優(yōu)化

2.4.1 誘導時間的優(yōu)化結(jié)果

條件相同時，在相同宿主菌中，由于誘導時間的不同蛋白表達量也存在差異，因此本試驗比較了在相同宿主菌中誘導時間的長短對蛋白表達量的影響（結(jié)果如圖3-1、3-2、3-3所示）。Rosetta -pBV220-CaIFN-α誘導后1～6 h表達量分別為：1 h 11%、2 h 16%、3 h 17%、4 h 29%、5 h 18% 6 h 24%，蛋白在Rossta宿主菌中4 h表達量最高，表達量約為29%；BL21-pBV220-CaIFN-α誘導后1～6 h表達量分別為：1 h 11%、2 h 14%、3 h 16%、4 h 22%、5 h 27%、6 h 21%，蛋白在BL21宿主菌中5 h表達量最高，表達量約為27%；DH5α- pBV220-CaIFN-α誘導后1～6 h表達量分別為：1 h 9%、2 h 16%、3 h 19%、4 h 32%、5 h 23%、6 h 15%，蛋白在DH5α宿主菌中4 h表達量最高，表達量約為32%。

2.4.2 宿主菌的優(yōu)化結(jié)果

對于不同的宿主菌，蛋白的表達量也存在差異，因此本試驗具體比較了3種宿主菌對蛋白表達量的影響（如圖4-1所示）。圖中顯示，蛋白在DH-5α宿主菌中表達量最高，為32%左右。在相同條件下，同一宿主菌中，誘導時間的不同蛋白表達量也存在差異。根據(jù)誘導時間，宿主菌的不同確定出最佳誘導時間為4 h，最佳宿主菌為DH-5α。

3 討論

對于犬病毒病的預防，目前國內(nèi)主要采用注射犬五聯(lián)弱毒疫苗，但由于母源抗體的干擾及毒株的抗原漂移，常導致免疫失敗，因此研制安全高效的干擾素抗病毒制劑具有重大意義。由于犬α-干擾素屬于Ⅰ型干擾素，由不含內(nèi)含子的多拷貝基因編碼，因此本研究直接以犬肝基因組DNA為模板克隆出了犬α-干擾素基因，省去了從白細胞中提取mRNA為模板進行RT-PCR擴增的繁冗。由于大腸埃希菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、目標基因表達水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強等特點[6]，因此試驗中選擇DH-5α、BL21、Rosetta 3種宿主菌作為試驗對象，確定了表達蛋白的最佳時間和高效表達的宿主菌，為表達產(chǎn)物的純化提供前提。研究結(jié)果表明，本試驗構(gòu)建的工程菌在DH-5α宿主菌中4 h時表達量最高，為進一步探討犬α-干擾素蛋白的生物學特性、研制新型犬α-干擾素制劑，對我國犬α-干擾素生物制劑的生產(chǎn)、犬類病毒病的防治奠定了基礎(chǔ)。

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