應(yīng)用EMA-PCR檢測沙門氏菌活菌的研究

趙素君 曹 冶 謝 晶 李江凌 王秋實 葉勇剛 羅丹丹 葉健強 廖黨金

（四川省畜牧科學研究院，成都 610066）

沙門氏菌（Salmonella）是腸桿菌科中一種重要的人畜共患病原菌，分布廣泛，血清型繁多。常因污染飼料、水源、土壤、畜舍設(shè)施等造成畜禽感染。感染畜禽后可引起雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒、流產(chǎn)等多種動物疾病?；疾⌒笄蒹w內(nèi)含有大量的沙門氏菌，在其排泄物中也經(jīng)常帶菌，因而成為新的傳染源，如不及時檢測發(fā)現(xiàn)和控制處理，則可導(dǎo)致畜禽間及養(yǎng)殖場間的水平傳播，甚至垂直傳播給子代畜禽。為有效地預(yù)防和控制疾病發(fā)生，建立快速、敏感而又特異的檢測沙門氏菌的方法是非常必要的。長期以來，人們對沙門氏菌的檢測大多采用傳統(tǒng)的方法，即選擇性或非選擇性增菌、可疑細菌的分離、生化反應(yīng)及血清學鑒定等常規(guī)方法，檢測結(jié)果雖然在一定程度上準確、可靠，但檢測過程煩瑣、費時費力，而且腸桿菌科細菌間的生化反應(yīng)多有交叉，因此，傳統(tǒng)的檢測方法在快速、敏感與特異性等方面存在一定的局限性[1，2]。

近年來，PCR技術(shù)以靈敏度高、特異性強、簡便和快速等優(yōu)點作為分子水平的快速檢測技術(shù)越來越多的被應(yīng)用于沙門氏菌的檢測中[3-5]。沙門氏菌的侵襲蛋白決定細菌進入宿主上皮細胞的能力，與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)。其中，invA基因編碼的侵襲蛋白A是吸附和侵襲上皮細胞的表面抗原，是主要毒力因子，在沙門氏菌的致病過程中起著重要作用[6-8]。invA基因序列在沙門氏菌屬具有很高的同源性，非常保守。是當前沙門氏菌檢測的主要靶點[9]。

由于樣品中常常存在死亡沙門氏菌，死菌雖然已經(jīng)沒有危害性，但在PCR檢測中也能擴增出目的基因，從而使檢測結(jié)果出現(xiàn)大量的假陽性，干擾了檢測的真實性。所以區(qū)分死、活細菌方法的建立對沙門氏菌檢測極其重要。本研究利用疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）能穿過死細菌的細胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結(jié)合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴增的特性，將EMA與PCR技術(shù)結(jié)合，通過特異性擴增編碼侵襲蛋白A的invA基因，建立一種快速、有效的檢測沙門氏菌活菌的方法，具有很好的實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 陽性菌株：豬霍亂沙門氏菌CVCC504、鼠傷寒沙門氏菌CVCC541、雞白痢沙門氏菌CVCC525；對照菌株：金黃色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056；腸毒性大腸桿菌CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215，腸出血性大腸桿菌CVCC248，腸侵襲性大腸桿菌CVCC2072，腸致病性大腸桿菌CVCC251，均購自中國獸醫(yī)藥品檢查所中國獸醫(yī)微生物菌種保存管理中心。

1.1.2 主要試劑 EMA為Biotium公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker購自Takara公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純；引物合成及核酸測序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中沙門氏菌invA基因序列設(shè)計特異性引物，引物序列為F：5′-GATTCTGGTACTAATGGT GATGATC-3′；R：5′-GCCAGGCTATCGCCAATAAC-3′，擴增目的片段長度為285bp。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌活菌和死菌的制備 接種沙門氏菌CVCC504，培養(yǎng)16 h后，取1ml菌液于EP管中，6 000 rpm，4℃，離心5 min，收集菌體沉淀，加入無菌生理鹽水重懸沉淀，制成活菌懸液。再將活菌懸液72℃水浴15 min，得到死菌懸液。

1.2.2 EMA處理 取適量菌懸液于EP管中，加入終濃度為100μg/ml 的EMA，在黑暗處放置5min后，于650W鹵素光源光照處理1min，光源放在離樣品管20cm處，光照時EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。EMA處理后的樣品，用于下面的DNA模版的制備。

1.2.3 模版DNA的制備 取1 ml菌液，12 000 rpm離心5 min，去除上清液，然后用100 ul滅菌去離子水重懸。然后，100℃水浴5 min后，再10 000 rpm離心5 min，上清液用作PCR檢測。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer（含MgCl2）2.5μl，dNTP mixture（各2.5mM）2μl，引物（20μM）各0.5μl，模板DNA 1μl，TaKaRa Ex Taq（5 U/μl）0.2μl，滅菌雙蒸水加至25μl。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化主要通過退火溫度來實現(xiàn)，為了獲得特異性的擴增片段，采用Touchdown PCR方法確定PCR反應(yīng)合適的退火溫度，設(shè)定退火溫度范圍65℃～45℃。擴增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 PCR特異性檢測 以CVCC504、CVCC541、CVCC525作為陽性菌株；以CVCC3055、CVCC3056、CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC248、CVCC251、CVCC2072作為對照菌株，進行PCR擴增，結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，出現(xiàn)特異性擴增條帶，即為檢測陽性，否則為陰性。

1.2.6 PCR靈敏度檢測 接種沙門氏菌CVCC504，培養(yǎng)16 h，取1ml菌液于EP管中，遞倍稀釋10-1～10-9，進行如上模板DNA制備，PCR檢測其靈敏度。同時，采用平板法進行細菌計數(shù)，通過牛肉膏蛋白胨瓊脂平板進行對照計數(shù)。分別取遞倍稀釋100～10-9的菌液50μl進行涂板，37℃過夜培養(yǎng)，然后分別進行計數(shù)，計算檢測靈敏度。

1.2.7 不同活細胞比例的混合菌懸液的EMA-PCR擴增 分別配制含有100%、75%、50%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0%的沙門氏菌CVCC504活細胞菌懸液混合體系，分別加入終濃度為100μg/ml 的EMA，在黑暗處放置5min后，樣品置于冰上用650W鹵素光源距離20cm處光照處理1min，經(jīng)EMA處理后的菌液，用于如上DNA模版的制備，進行PCR擴增。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過Touchdown PCR方法確定最佳的PCR反應(yīng)條件為：94°C 4min；94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 30sec，28個循環(huán)；72°C延伸5min。

2.2 沙門氏菌invA基因的PCR特異性檢測結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示（見圖1），只有沙門氏菌CVCC504、CVCC541、CVCC525擴增出285bp的目的條帶，DNA測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank上序列完全一致。而對照菌株CVCC3055、CVCC3056、CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC248、CVCC251、CVCC2072均未檢測到特異性條帶，結(jié)果為陰性。

2.3 沙門氏菌invA基因的PCR檢測靈敏度分析

將各梯度稀釋液100～10-9分別進行invA基因的PCR擴增，結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示其靈敏度檢測低限為10-9，而相應(yīng)的平板計數(shù)為11CFU/ml。

2.4 沙門氏菌EMA-PCR區(qū)分死菌與活菌的檢測結(jié)果

EMA-PCR擴增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示除了全部是死菌的組外，其他含活菌各種比例的混合菌液中，均出現(xiàn)特異性擴增條帶，見圖3。

3 討論

疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）是一種熒光插入型的核酸結(jié)合染料，能穿過死細菌的細胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結(jié)合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴增；而完整未受損傷的活菌細胞膜能阻止EMA滲透，對活菌DNA不起作用[10，11]。PCR檢測方法的特異性與靈敏度主要取決于相應(yīng)檢測靶點的選擇，invA作為沙門氏菌的持家基因，具有很好的屬內(nèi)保守性與屬間特異性，本研究選取invA基因作為靶序列設(shè)計特異性引物，將EMA與PCR技術(shù)結(jié)合，成功地建立了一種快速、有效的檢測沙門氏菌活菌的方法。由于在檢測過程中除去了死細胞DNA對PCR的干擾，從而大大提高了檢測結(jié)果的準確性和真實性。由于沙門氏菌血清型較多，2001年就已經(jīng)報道有2523種血清型[12]。本研究旨在提出一種鑒定沙門氏菌活菌的PCR檢測方法，鑒定結(jié)果往往需要配合血清型分析鑒定器種類。該方法操作簡單，大大縮短了傳統(tǒng)常規(guī)方法的檢測周期，對沙門氏菌的檢測具有較好的應(yīng)用價值。

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