孕烷X受體抗食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

謝晶華 解智慧 史祖宣 樊青霞 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，河南 鄭州 450052)

孕烷X受體抗食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

謝晶華 解智慧 史祖宣 樊青霞 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，河南 鄭州 450052)

目的 研究孕烷X受體(PXR)抗食管癌EC9706細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法 使用利福平活化食管鱗癌 EC9706細(xì)胞中的PXR，阿霉素(ADM)誘導(dǎo)高表達(dá)PXR的EC9706細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的增殖周期，MTT法觀察細(xì)胞凋亡率，Western印跡和免疫組化法檢測(cè)Caspase-3，Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 ADM處理可以明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng);使細(xì)胞呈明顯凋亡改變;利福平誘導(dǎo)PXR高表達(dá)的EC9706細(xì)胞凋亡減少，抑制Caspase-3的蛋白水平，上調(diào)蛋白Bcl-2的表達(dá)，表明PXR在抗食管鱗癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。結(jié)論 PXR可能是通過(guò)降低Caspase-3和升高Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞EC9706的凋亡。

食管癌;細(xì)胞凋亡;孕烷X受體;Caspase-3;Bcl-2

孕烷X受體(PXR)，亦稱為類固醇X受體，其主要生物學(xué)功能是參與機(jī)體對(duì)內(nèi)源及外源化合物的代謝及排泄過(guò)程，是核受體家族重要成員之一。核受體在藥物代謝轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物之間相互作用中扮演重要角色，尤其是PXR，其配體具有泛宿主性，很多藥物包括抗癌藥物都是其配體。近幾年對(duì)PXR的基因定位、基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、組織分布、作用機(jī)制及其與多種腫瘤的關(guān)系等研究取得一定進(jìn)展。本文擬研究PXR在抗食管癌 EC9706細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細(xì)胞株EC9706購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)DIOMED;胎牛血清(FBS)購(gòu)自O(shè)dyssey公司;胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司;MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;羊抗鼠熒光二抗700購(gòu)自LI-COR Biosciences基因公司;羊抗兔熒光二抗800購(gòu)自LI-COR Biosciences基因公司;總RNA抽提試劑盒和RT-PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠的二抗購(gòu)自Rockland公司;β-actin鼠抗人的單抗購(gòu)自 Sigma公司;BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Pierce公司;蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自Fermentas公司。

1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將EC9706細(xì)胞分為兩組，一組加0.1%二甲基亞砜(DMSO)作為處理對(duì)照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。預(yù)處理24 h后，接種于96孔板，每孔約1×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，兩組均設(shè)調(diào)零空白對(duì)照組(不加細(xì)胞，只加相應(yīng)培養(yǎng)基)，連續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)分別加入0.1%DMSO、10 μmol/L 利福平進(jìn)行處理。將 1 μg/ml ADM 分別加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在第1、3、5、7天時(shí)，每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，溶解紫色結(jié)晶物，在微孔板振蕩器上震蕩10 min。用Model 550型酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm測(cè)吸光度(OD值)，以空白對(duì)照組調(diào)零。試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

通過(guò)下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組 OA490值-對(duì)照組 OA490值)/對(duì)照組OA490值×100%。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞用不含血清的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h，使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，處于同一細(xì)胞周期，然后將細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×104個(gè)/ml，各取5 ml細(xì)胞懸液培養(yǎng)于75 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)、消化、離心、收集各用藥組(一組加0.1%DMSO作為處理對(duì)照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組)和陰性對(duì)照組培養(yǎng)48 h的EC9706細(xì)胞，將1 μg/ml ADM分別加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用冷PBS液洗滌細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷70%的乙醇并均勻吹打，盡量制備成單細(xì)胞懸液，4℃冰箱固定24 h，隨后再用冷PBS液洗滌細(xì)胞兩次去除固定液，加1 ml碘 化 丙 錠 染 液(含 碘 化 丙 錠 100 μg/ml，RNA 酶100 μg/ml)，混勻，置4℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀，用氬離子激發(fā)碘化丙錠產(chǎn)生紅色熒光，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光，檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。用計(jì)算機(jī)自帶Multicycle(Phoenix Flow System，San Diego，CA，USA)軟件分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及細(xì)胞周期百分?jǐn)?shù)。

1.4 Western印跡檢測(cè)高表達(dá)PXR蛋白的EC9706細(xì)胞以及野生型 EC9706細(xì)胞中 Bcl-2、Caspase-3、B

(1)將EC9706細(xì)胞分為兩組：一組加0.1%DMSO作為處理對(duì)照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。將1 μg/ml ADM分別加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，作用48 h后，提取細(xì)胞核蛋白。約6×106個(gè)細(xì)胞，加預(yù)冷PBS漂洗2次，用細(xì)胞刮子快速將細(xì)胞刮下，500 r/min×3 min，棄上清，盡可能干燥沉淀，加200 μl細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白抽提試劑(CERI)，劇烈漩渦振蕩15 s，充分重懸，冰上10 min。

(2)從不同蛋白樣品中取出等量蛋白(50 μg)與1×SDS凝膠上樣緩沖液混合，加入4%體積的 β-巰基乙醇，煮沸10 min。然后在4℃下，15 000 r/min離心5 min。蛋白上樣，經(jīng)由10%SDS-PAGE分離膠分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將此膜取下，剪角后在5%脫脂奶粉封閉液中緩慢搖動(dòng)2～4 h。然后。將特異性一抗按1∶1 000～1∶2 000稀釋。與膜一起孵育過(guò)夜。1×PBST洗滌3次，每次10 min。隨后將此膜與相應(yīng)的二抗(1∶3 000～1∶4 000)一起孵育4 h。在1×PBST洗滌3次后，利用增強(qiáng)性化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)檢測(cè)特異性蛋白條帶。由兩位資深科研中心教授獨(dú)立觀察每張切片后一起做出判斷。每例切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

參照吳嬋妮等〔2〕的方法如下計(jì)算結(jié)果：陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 免疫組化法檢測(cè)EC9706細(xì)胞中的Capase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

載玻片經(jīng)泡酸、清洗、高溫滅菌后置于6孔培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化成單細(xì)胞懸液后，將EC9706細(xì)胞分為兩組：一組加0.1%DMSO作為處理對(duì)照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。將1 μg/ml ADM分別加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，作用48 h后，以每毫升2×105個(gè)細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2.5 ml，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，丙酮固定10 min。室溫下0.5%H2O2-甲醇作用30 min，山羊血清封閉1 h，PBS洗滌后滴加一抗，4℃過(guò)夜，PBS洗滌后滴加生物素標(biāo)記的兔抗鼠二抗工作液，室溫作用30 min，PBS洗滌后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液作用1 h，PBS洗滌后DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和倍增時(shí)間

在液體懸浮培養(yǎng)條件下，EC9706細(xì)胞呈單個(gè)散在貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞種植密度為5×104/ml，此濃度細(xì)胞從換液后的第24～96小時(shí)呈指數(shù)增殖，實(shí)驗(yàn)測(cè)得EC9706細(xì)胞倍增時(shí)間為20～24 h(見(jiàn)圖1)。

圖1 食管癌EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 利福平活化核受體PXR對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響

2.2.1 利福平對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞核受體PXR表達(dá)的影響

根據(jù)以上結(jié)果，選擇EC9706細(xì)胞作為研究PXR基因功能的對(duì)象。EC9706細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L利福平處理 48 h后，提取EC9706細(xì)胞核蛋白，采用Western印跡方法進(jìn)一步檢測(cè)PXR核蛋白表達(dá)水平變化。分子量50 kD位置，與0.1%DMSO處理對(duì)照組相比，利福平處理組核蛋白條帶明顯增粗，顯色較深。這表明利福平刺激后可增強(qiáng)PXR蛋白在EC9706細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)(圖2)。以上結(jié)果表明，利福平預(yù)處理后，可活化PXR，增強(qiáng)其核蛋白表達(dá)水平。

2.2.2 利福平活化PXR對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響 在10 μmol/L利福平作用下，EC9706細(xì)胞增殖明顯加快，第3、5、7天的490 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD)分別為：0.682±0.048、1.183±0.156、1.817±0.095;而0.1%DMSO處理對(duì)照組相應(yīng)的OD值分別為：0.528±0.035、0.920±0.036、1.402±0.092。相應(yīng)時(shí)間內(nèi)，利福平組OD值均明顯高于DMSO組(P＜0.05)。而第1天，利福平組和DMSO組OD值〔(0.155±0.006)vs(0.163±0.004)〕之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明利福平活化PXR后，可促進(jìn)EC9706細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖3。

圖2 利福平處理EC9706細(xì)胞后PXR表達(dá)變化

圖3 利福平對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響

2.3 PXR在抗ADM誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡中的作用

2.3.1 流式細(xì)胞儀觀察到的ADM處理空白組和PXR+利福平組EC9706細(xì)胞的增殖周期 在1 μg/ml阿霉素作用下，DMSO組EC9706細(xì)胞增殖明顯加快，相應(yīng)時(shí)間內(nèi)，利福平組OD值均明顯低于DMSO組(P＜0.05)。結(jié)果表明利福平活化PXR后，可抑制EC9706細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖4。

2.3.2 MTT觀察ADM處理空白組和PXR+RIF組EC9706細(xì)胞的凋亡率 在1 μg/ml ADM作用下，ADM處理的DMSO組EC9706細(xì)胞凋亡明顯增多(P＜0.01);ADM處理的RIF組EC9706細(xì)胞凋亡明顯增多(P＜0.01)。結(jié)果表明利福平活化PXR后，再用利福平處理后可降低EC9706細(xì)胞的凋亡率。見(jiàn)圖5。

2.3.3 Western印跡檢測(cè)ADM對(duì)利福平與DMSO組EC9706細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 ADM處理EC9706細(xì)胞后Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)，以光密度指數(shù)(OD)表示三種蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。所有樣品檢測(cè)均以DMSO處理組細(xì)胞為空白對(duì)照，用ipp7c軟件計(jì)算出Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的OD值。ADM處理的PXR+利福平組的Caspase-3蛋白的FI值均低于對(duì)照組;Bcl-2蛋白的OD值均高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。但Bax蛋白的OD值與對(duì)照組相比，則無(wú)明顯差異(P＞0.05)(圖6)。

圖4ADM處理DMSO組和RIF組對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響

圖5ADM處理DMSO組和RIF組EC9706細(xì)胞凋亡率的影響

圖6 Western印跡檢測(cè)ADM處理DMSO組和利福平組EC9706細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

2.3.4 免疫組化法觀察到ADM處理的DMSO組和RIF+PXR組的Caspase-3，Bcl-2，Bax的表達(dá)情況 Caspase-3主要定位于細(xì)胞質(zhì)，也可見(jiàn)于細(xì)胞核。Bcl-2和Bax定位于細(xì)胞質(zhì)，亦可見(jiàn)于胞膜和核膜。著色明顯高于背景，在相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，不著色或顯色強(qiáng)度與背景無(wú)差別者為陰性細(xì)胞。見(jiàn)圖7。

圖7 免疫組化法觀察到ADM處理的兩組Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)情況(×400)

3 討論

PXR可通過(guò)上調(diào)多重抗凋亡基因包括 BAG3、BIRC、2MCL-1，下調(diào)凋亡基因如 BAKl、TP53/P53，Bcl-xL而起到對(duì)抗細(xì)胞凋亡的功能，從而對(duì)抗 DCA/LCA誘導(dǎo)的結(jié)腸癌變〔3〕。Daisuke等〔4〕報(bào)道PXR在食管鱗癌中是高表達(dá)的，而且是判斷ESCC患者的一種潛在的預(yù)后因子。

ADM是一種常見(jiàn)的抗腫瘤藥物，其抗瘤譜較廣，對(duì)乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多種癌癥都有一定療效，而且是治療食管癌效果最好的化療藥物之一。ADM屬細(xì)胞周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，ADM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，可能是由于其部分分子結(jié)構(gòu)可嵌入到DNA雙鏈中形成穩(wěn)定的復(fù)合物，影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，阻止DNA復(fù)制和RNA的合成，還能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖〔1〕。有研究證實(shí)PXR的配體利福平及其他配體可增強(qiáng)CYP3A4和MDRl表達(dá)，前者可代謝50%以上的處方藥，其中也包括部分抗癌藥物。PXR配體具有泛宿主性，一些抗癌藥如紫杉醇、順鉑等也是其配體，可通過(guò)PXR誘導(dǎo)MDRl表達(dá)，并可被酮康唑抑制〔5〕，這些研究提示PXR與EC9706細(xì)胞的抗凋亡調(diào)控相關(guān)。

PXR的表達(dá)部位主要在肝臟、小腸、腎臟及血腦屏障等組織細(xì)胞，這與經(jīng)其轉(zhuǎn)錄激活的下游靶酶或蛋白如 CYP3A4、CYP2B6、UGT1A1、MDR1等的表達(dá)部位基本一致。近年來(lái)在眾多腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了PXR的高表達(dá)，研究表明高表達(dá)PXR的腫瘤譜已經(jīng)從早期的性激素相關(guān)腫瘤得到了很大范圍的擴(kuò)展。在結(jié)腸癌〔6〕中也發(fā)現(xiàn)了PXR的表達(dá)并證實(shí)了與多藥耐藥的相關(guān)性。最近，在食道鱗狀上皮癌組織中，PXR蛋白及mRNA水平均明顯高于正常食道上皮組織〔2〕。

PXR抑制腫瘤細(xì)胞凋亡也可能是其誘導(dǎo)耐藥的機(jī)制之一。在人結(jié)腸癌細(xì)胞中，PXR活化導(dǎo)致了抗凋亡基因，如 BAG3，BIRC 2，MCL-1等表達(dá)上調(diào)，而包括BAK1和TP53在內(nèi)的促凋亡基因表達(dá)受到抑制〔7〕?？墒荲erma等〔8〕卻發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果。他們?cè)谌巳橄侔┘?xì)胞系MCF-7和ZR-75-1中發(fā)現(xiàn)，PXR的活化也可以通過(guò)一氧化氮(NO)依賴的途徑上調(diào) p53的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致促凋亡因子p21、PUMA、BAK表達(dá)增加，促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡。PXR對(duì)細(xì)胞凋亡的作用可能和性激素的表達(dá)水平及PXR對(duì)NO的誘導(dǎo)作用的強(qiáng)弱有關(guān)，具有一定的組織特異性，從而為研究化療藥物的選擇性和與激素類藥物的聯(lián)合用藥方面提供了參考。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PXR基因與凋亡蛋白Caspase-3在食管鱗癌中的表達(dá)明顯相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)其在食管鱗癌的發(fā)生與演進(jìn)中有著重要的作用與地位，是食管鱗癌治療中的一個(gè)靶基因，因此對(duì)PXR的研究及應(yīng)用這些研究成果有望使其成為食管鱗癌診斷和基因、免疫治療的新靶點(diǎn)，為食管鱗癌的診斷、治療開(kāi)辟一條新途徑。本研究證明，藥理學(xué)活化PXR足夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的EC9706細(xì)胞的凋亡，基因表達(dá)分析說(shuō)明PXR的抗凋亡作用與多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。PXR作為抗腫瘤細(xì)胞凋亡作為在腫瘤的治療新靶點(diǎn)方面已引起重視，本研究為PXR在食管癌中的治療作為新的靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

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R329

〕 A 〔

1005-9202(2012)22-4962-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.051

樊青霞(1952-)，女，主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤研究。

謝晶華(1987-)，女，碩士，主要從事惡性腫瘤研究。

〔2011-12-17收稿 2012-04-05修回〕

(編輯 趙慧玲)