轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子中Bt蛋白含量測(cè)定方法的研究

陳笑蕓 汪小福 周 育 繆青梅 方 敬 徐俊鋒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021)

轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子中Bt蛋白含量測(cè)定方法的研究

陳笑蕓 汪小福 周 育 繆青梅 方 敬 徐俊鋒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021)

采用ELISA技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因水稻中Bt蛋白的含量，判斷水稻樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。利用研磨、酶標(biāo)、孵育等技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理。采用陽(yáng)性質(zhì)控物濃度等倍稀釋方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.997 4。用一系列不同轉(zhuǎn)基因含量的標(biāo)準(zhǔn)基體材料，分析方法的最低檢測(cè)限，靈敏度達(dá)0.1%。通過(guò)對(duì)我國(guó)進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn)的轉(zhuǎn)Bt基因水稻品系TT51－1和科豐6號(hào)的測(cè)試，表明該方法與普通PCR方法真實(shí)性和靈敏度一致，可以廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bt基因水稻及其粗加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。為轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管和安全性評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

Bt蛋白 轉(zhuǎn)基因水稻 快速檢測(cè) 靈敏度

水稻作為世界主要糧食作物，也是蟲(chóng)害最多的糧食作物之一。2009年底，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻華恢1號(hào)和轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲(chóng)水稻Bt汕優(yōu)63在湖北省生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書(shū)。隨著轉(zhuǎn)基因水稻將從小型試驗(yàn)逐漸走向大規(guī)模種植，給轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管、追溯提出了更高的要求［1］，快速、精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)體系的建立是安全監(jiān)管的有效途徑之一。

目前，轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)技術(shù)主要分為兩大類［2－5］，一類是基于蛋白質(zhì)檢測(cè)的蛋白檢測(cè)技術(shù)，另一類是基于核酸檢測(cè)的檢測(cè)技術(shù)。其中ELISA檢測(cè)方法是比較理想的方法。因?yàn)樵贓LISA檢測(cè)中將抗原與抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物的高效催化作用結(jié)合起來(lái)，從而使測(cè)定方法達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、敏感度高等特點(diǎn)。并且ELISA檢測(cè)既可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺做出定性分析，也可通過(guò)酶標(biāo)儀讀數(shù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。陳松等［6］對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉花建立了雙抗夾心ELISA定量檢測(cè)方法，徐寶粱等［7］用試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)基因棉子殼中Bt蛋白含量的較系統(tǒng)試驗(yàn)，建立了轉(zhuǎn)基因Bt棉花蛋白檢測(cè)技術(shù)。而快速、穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)Bt基因水稻蛋白檢測(cè)方法研究較少。本研究應(yīng)用檢測(cè)試劑盒，以不同轉(zhuǎn)Bt基因水稻品系為研究材料，采用ELISA方法檢測(cè)水稻中Bt蛋白含量，以期建立快速、靈敏、有效的轉(zhuǎn)基因水稻蛋白檢測(cè)體系。

1 材料和方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻品系TT51－1、科豐6號(hào):農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心;非轉(zhuǎn)基因水稻品種明恢63、明恢86:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;靈敏度檢測(cè)所用標(biāo)準(zhǔn)試樣:將經(jīng)鑒定為轉(zhuǎn)基因的水稻品系與非轉(zhuǎn)基因水稻混合，實(shí)驗(yàn)室自制。

Bt－Cry1Ab/1Ac ELISA試劑盒:美國(guó)dgdia公司。Model 680酶標(biāo)儀、1575洗板機(jī):BIO－RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取磨碎的100 mg樣品，以1∶10的比例加入樣品提取液，混均后靜置5 min，吸取上清液加入到微孔中。加酶標(biāo)記物，室溫孵育2 h，洗板(重復(fù)6－7次)，加入 3，3'，5，5'－ 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，15 min后，用3 mol/L的硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450處的吸光值。

1.2.2 測(cè)試對(duì)照設(shè)置

為避免試驗(yàn)污染而造成蛋白測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)必須設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照用陽(yáng)性材料前處理后作為底物。陰性對(duì)照用陰性材料前處理后作為底物?？瞻讓?duì)照用ddH2O作為底物。

1.2.3 定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

將陽(yáng)性質(zhì)控物按 20、10、5 、2.5、1.25、0.625、0.315 ng/mL進(jìn)行稀釋，以陽(yáng)性質(zhì)控物中Bt蛋白濃度為橫坐標(biāo)，扣除空白對(duì)照值OD450為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 定量檢測(cè)極限(LOD)

用一系列不同轉(zhuǎn)基因含量(5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和 0.01%)的標(biāo)準(zhǔn)基體材料，經(jīng)前處理后作為ELISA反應(yīng)底物。經(jīng)過(guò)至少3次重復(fù)后，確定可以穩(wěn)定檢測(cè)樣品的最低轉(zhuǎn)基因含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測(cè)體系陽(yáng)性質(zhì)控物標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

陽(yáng)性質(zhì)控物稀釋處理后的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。以陽(yáng)性質(zhì)控物中Bt蛋白濃度為橫坐標(biāo)，扣除空白對(duì)照OD450值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=0.052 6x+0.011 3(見(jiàn)圖1)，相關(guān)系數(shù)為:R2=0.997 4，具有很好的相關(guān)性，表明此檢測(cè)體系可用于Bt蛋白含量測(cè)定，Bt蛋白含量的計(jì)算公式為:ρ=(θ－0.011 3)÷0.052 6

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定數(shù)據(jù)

圖1 陽(yáng)性質(zhì)控物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 轉(zhuǎn)Bt基因水稻Bt蛋白的線性范圍

提取轉(zhuǎn)Bt基因水稻TT51－1純系中的Bt蛋白，并將提取液做2倍梯度稀釋。稀釋倍數(shù)、不同稀釋倍數(shù)下Bt蛋白濃度及扣除空白后的吸收值見(jiàn)表2。

表2 TT51－1和科豐6號(hào)純系轉(zhuǎn)Bt水稻各梯度吸光度

2.2.1 轉(zhuǎn)Bt基因水稻TT51－1純系Bt蛋白的線性

TT51－1純系提取液 OD450為0.946，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得Bt濃度為18.683 ng/mL。以不同稀釋倍數(shù)下Bt蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)(扣除空白對(duì)照)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從16倍稀釋開(kāi)始Bt蛋白濃度與吸光度成線性關(guān)系，回歸方程 y=0.354 0x －0.008 6，相關(guān)系數(shù)為 0.998 4，具有很好的相關(guān)性。16倍稀釋時(shí)，Bt蛋白質(zhì)量濃度為1.168 ng/mL，256 倍稀釋時(shí)，Bt蛋白濃度為 0.070 ng/mL，因此，此檢測(cè)體系測(cè)定TT51－1 Bt蛋白的線性范圍為 0.070 ～1.168 ng/mL。

2.2.2 轉(zhuǎn)Bt基因水稻科豐6號(hào)純系Bt蛋白的線性

科豐6號(hào)純系提取液 OD450為1.004，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得Bt濃度為18.870 ng/mL。以不同稀釋倍數(shù)下Bt蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)(扣除空白對(duì)照)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從16倍稀釋開(kāi)始Bt蛋白濃度與吸光度成線性關(guān)系，回歸方程 y=0.300 3x+0.001 7，相關(guān)系數(shù)為 0.990 7，具有很好的相關(guān)性。16倍稀釋時(shí)，Bt蛋白濃度為1.150 ng/mL，256 倍稀釋時(shí)，Bt蛋白濃度為 0.036 ng/mL，因此，此檢測(cè)體系測(cè)定科豐6號(hào)Bt蛋白的的線性范圍為0.036 ～1.150 ng/mL。

2.3 轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子中Bt蛋白含量測(cè)定

用試劑盒測(cè)定了TT51－1、科豐6號(hào)、明恢63和明恢86純系的 OD450?？鄢瞻讓?duì)照，代入 y=0.052 6x+0.011 3，得到轉(zhuǎn) Bt基因水稻純系 TT51 －1的Bt蛋白含量為18.683 ng/mL;轉(zhuǎn)Bt基因水稻科豐6號(hào)的Bt蛋白含量為18.870 ng/mL;明恢63和明恢86吸光度均為負(fù)值，表明未檢測(cè)到Bt蛋白。

2.4 ELISA檢測(cè)體系檢測(cè)水稻中Bt蛋白含量的檢測(cè)極限(LOD)

按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配置混樣，TT51－1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%樣品的吸光值分別為 0.197、0.050、0.018、0.090、0.000 和 －0.004(表3)。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為 y=3.856 9x+0.004 9，R2=0.996 4，在0.1%～5%范圍內(nèi)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與吸光度呈現(xiàn)很好的相關(guān)性?？曝S6號(hào)5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01% 樣品的吸光值分別為 0.250、0.089、0.037、0.008、－0.003、－0.005，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為 y=4.957 2x+0.003，R2=0.996 3，在0.1%～5%，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)與吸光度呈現(xiàn)很好的相關(guān)性。此ELISA檢測(cè)體系的檢測(cè)極限可達(dá)0.1%，可滿足轉(zhuǎn)基因生物安全檢測(cè)監(jiān)管需求。

表3 TT51－1和科豐6號(hào)各質(zhì)量分?jǐn)?shù)吸光度和線性方程

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子蛋白檢測(cè)體系及檢測(cè)極限

本試驗(yàn)利用Bt－Cry1Ab/1Ac ELISA試劑盒對(duì)不同濃度梯度的轉(zhuǎn)Bt基因水稻進(jìn)行了較為全面的研究，優(yōu)化了反應(yīng)條件，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.052 6x+0.011 3，相關(guān)系數(shù) R2=0.997 4，建立了穩(wěn)定、快速的Bt蛋白檢測(cè)體系。轉(zhuǎn)Bt水稻TT51－1和科豐6號(hào)中的Bt蛋白的線性范圍分別為0.070～1.168 ng/mL和0.036 ～1.150 ng/mL。其檢測(cè)靈敏度達(dá)到了 0.1%。除準(zhǔn)備樣品的時(shí)間外，測(cè)試過(guò)程所需時(shí)間約為2.5 h，比其他檢測(cè)蛋白方法更為省時(shí)。該體系的建立，對(duì)于大規(guī)模的檢測(cè)水稻種子中是否含有Bt基因成分提供了很好的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法和規(guī)范的檢測(cè)程序，為轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供了技術(shù)平臺(tái)。

3.2 轉(zhuǎn)Bt基因水稻蛋白檢測(cè)體系的應(yīng)用

目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)監(jiān)管是基于核酸的PCR檢測(cè)方法體系，無(wú)論是定性PCR方法，還是定量PCR方法，由于建立在DNA水平上的PCR方法的組成體系復(fù)雜，參數(shù)較多，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)比較長(zhǎng)且對(duì)操作人員要求比較高［10－11］。而此蛋白檢測(cè)體系操作簡(jiǎn)單，且快速、穩(wěn)定，對(duì)大規(guī)模篩選檢測(cè)監(jiān)管極為有利。

本試驗(yàn)用ELISA方法和普通PCR方法同時(shí)測(cè)定了不同轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%)的標(biāo)準(zhǔn)基體材料，真實(shí)性和靈敏度完全一致，且本方法檢測(cè)效率明顯高于普通PCR方法。本試驗(yàn)方法針對(duì)檢測(cè)樣品亦有不足之處，只能對(duì)原材料或粗加工產(chǎn)品進(jìn)行快速檢測(cè)，而不適合用于一些深加工品或成分復(fù)雜的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品中，蛋白質(zhì)性質(zhì)往往發(fā)生改變，不能被抗體有效識(shí)別［12－14］。

4 結(jié)論

本研究采用ELISA技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因水稻中Bt蛋白的含量，判斷水稻樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，建立了快速穩(wěn)定的轉(zhuǎn)Bt基因水稻蛋白定性定量檢測(cè)方法。該方法制作的陽(yáng)性質(zhì)控物標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.997 4，檢測(cè)靈敏度達(dá)0.1%。該方法與普通PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，且效率明顯提高，可以廣泛地應(yīng)用到轉(zhuǎn)Bt基因水稻及其粗加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。

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Protein Content in Bt－Gene Rice Seed

Chen Xiaoyun Wang Xiaofu Zhou Yu Miao QingmeiFang Jing Xu Junfeng
(Institute of Quality Standards for Agricultural Products，Zhejiang Academy of Agricultural Science，Hangzhou 310021)

In this study，the enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)has been develpoed for the detection of Bt protein content in transgenic Bt rice to evaluate the presence of genetically modified ingredients in rice samples.The sample pre － treatment step involved in grinding，enzymatic labeling reaction and incubation process.The standard curve was constructed by dilution of the the positive control material with the same dilution factor，and the correlation coefficient is 0.997 4.A range of different standards containing of genetically modified ingredients were used to analyze the limit of detection method.The results showed the detection sensitivity is up to 0.1%.Through testing the transgenic Bt rice strain TT51 －1 and Kefeng 6 which are putting into the production test in China，the ELISA method developed demonstrated consistency with ordinary PCR methods in both authenticity and sensitivity aspects.Therefore，this ELISA method could be widely applied to detect genetically modified ingredients in transgenic Bt rice or raw commodities，providng technical support for the safety regulation and evalution of genetically modified organisms.

Bt protein，transgenic rice，rapid detection，sensitivity

Q788

A

1003－0174(2012)03－0121－04

浙江省重大科技專項(xiàng)(2008C12074)

2011－06－10

陳笑蕓，女，1977年出生，助理研究員，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

徐俊鋒，男，1977年出生，副研究員，轉(zhuǎn)基因與生物安全