美洛昔康對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響

朱秋偉 劉意 朱 晟

（常州市第二人民醫(yī)院普外科，江蘇 常州 213001）

在肝臟外科中，肝臟缺血再灌注損傷是一個常見的問題，也是導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭的重要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注導(dǎo)致肝臟損傷的機制與細(xì)胞能量代謝障礙、線粒體功能受損、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基產(chǎn)生、一些細(xì)胞因子的合成與釋放等有關(guān)。COX-2作為一種與損傷關(guān)系密切的活性蛋白酶，參與肝缺血再灌注損傷的過程，其具體表達以及COX-2抑制劑在肝缺血再灌注損傷的過程中的作用值得深入研究。本實驗旨在通過研究COX-2抑制劑美洛昔康對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用,為臨床缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療提供新的思路和方法。

1 材 料

1.1 試劑

美洛昔康（ 昆山龍燈瑞迪制藥）；哺乳動物組織和細(xì)胞抽提物蛋白酶抑制劑（Manmalian protease inhibitor mixture 100x）、哺乳動物組織蛋白質(zhì)抽提試劑（上海串俞博彩生物科技有限公司）；兔抗ERK，P-ERK（美國Biovision公司），COX-2多克隆抗體（美國Iabvision公司），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（上海英基生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）

1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（300±20）g，隨機分為A組（美洛昔康組），B組（缺血再灌注組）C組（手術(shù)對照組）每組10只動物。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 動物模型的建立

手術(shù)前12h動物開始禁食而自由飲水，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉后，常規(guī)消毒、鋪巾，上腹正中切口逐層進腹，分離肝門，無損傷動脈夾阻斷肝臟中葉、左葉血供，90min后恢復(fù)缺血肝葉血供，建立部分肝臟I/R模型，切口用1號線縫合。A組于缺血前30min經(jīng)腹腔注射美洛昔康（3mg/kg）；B組于缺血前30 min 經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水；C組僅作麻醉、開腹、不阻斷血流。

2.1.2 肝組織中COX-2檢測

采用Western Blot半定量分析檢測肝組織中COX-2表達情況。

2.1.3 肝臟組織學(xué)檢查

取左葉中部肝組織，經(jīng)10%甲醛固定石蠟包埋，切成4μm 厚的切片，HE染色，用普通光學(xué)顯微鏡檢查形態(tài)學(xué)改變情況。

2.1.4 肝功能檢測

血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST），乳酸脫氫酶（LDH）水平：應(yīng)用Olympus Au2700全自動生化分析儀（日本）進行分析，判定肝臟功能改變情況。

圖1 C組 HE ×400

圖2 A組 HE ×400

圖3 B組 HE ×400

2.1.5 超氧歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）的含量測定

肝組織中的超氧歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）的含量采用超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒進行檢測，操作按試劑盒說明進行。

2.1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 10.0軟件行方差齊性檢驗、方差分析，組間比較采用LSD法。

2.2 結(jié)果

2.2.1 肝臟缺血再灌注6h后血清中ALT、AST水平

再灌注6h后，A組和B組的ALT、AST均升高：血清中ALT、AST水平B組顯著高于C組（P＜0.01），A組顯著低于B組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠再灌注6h血清ALT、AST水平（±s）

表1 各組大鼠再灌注6h血清ALT、AST水平（±s）

注：與B組比較，*P＜0.01； 與C組比較，**P＜0.01

組別 n ALT（U/L）AST（U/L）A 10 213.7±33.08* 807.5±20.05*B 10 436.3±54.68** 1245.7±61.47**C 10 56.4±6.63 202.7±21.79

2.2.2 肝臟超氧歧化酶活性（SOD）的活性

缺血再灌注6h，B組大鼠肝臟SOD活性明顯高于C組（P＜0.01），美洛昔康可明顯降低缺血再灌注后升高的SOD活性（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠再灌注6 h肝組織MDA及SOD的活性（±s）

表2 各組大鼠再灌注6 h肝組織MDA及SOD的活性（±s）

注：與B組比較，*P＜0.01； 與C組比較，**P＜0.01

組別 n SOD（U/mg）MDA（μmol/g）A 10 0.929±0.05* 0.295±0.010*B 10 1.980±0.46** 0.433±0.039**C 10 0.415±0.05 0.173±0.023

2.2.3 肝組織內(nèi)丙二醛（MDA）的含量

缺血再灌注6h，B組大鼠肝臟MDA的含量明顯高于C組（P＜0.01），美洛昔康可明顯降低缺血再灌注后組織中MDA的含量（P＜0.01）。見表2。

2.2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察（圖1～3）

B組大鼠肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，肝組織內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集、浸潤，肝竇狹窄甚至閉塞。A組肝臟水腫程度明顯輕于B組，肝竇仍然保持通暢。C組為正常肝組織表現(xiàn)。

2.2.5 肝臟VEGF蛋白表達（圖4）

C大鼠肝組織VEGF僅有微弱表達；B組表達較A組明顯增強；C組可以降低缺血再灌注后肝臟VEGF表達，與B組比較明顯減弱。

3 討 論

圖4 肝組織中COX-2表達情況

肝臟缺血再灌注損傷是肝臟手術(shù)過程中常見的、多因素參與的病理生理變化，是導(dǎo)致肝臟外科術(shù)后肝功能衰竭甚至死亡的主要原因。在肝臟缺血再灌注過程中，早、中期損傷通常發(fā)生在再灌注之后0～6h，各種炎性因子顯著升高，肝功能損害較為明顯[1,2]。本實驗中以再灌注后6h作為觀察時間點，可確切反映大鼠肝臟缺血再灌注后的肝組織損傷情況以及肝功能狀況。氧自由基可氧化細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、死亡[3]。肝內(nèi)MDA的含量及SOD的活性可以反映肝細(xì)胞的損傷情況。本研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟缺血再灌注后6h，肝臟內(nèi)有較多中性粒細(xì)胞浸潤，肝臟MDA的含量及SOD活性明顯升高，出現(xiàn)嚴(yán)重的肝組織損害。病理觀察發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞水腫明顯，出現(xiàn)明顯的肝功能損害，ALT，AST水平明顯升高。

環(huán)氧化酶（COX）是一類具多重功能的跨細(xì)胞膜依賴性結(jié)合蛋白。其主要功能是催化AA生成類花生酸，如各種前列腺素（prostaglandins，PGs）、凝血烷A2（thromboxaneA2，TXA2）和白細(xì)胞三烯（1eukotrienes，LTs）等物質(zhì)。目前已明確，其至少有兩種亞型，即COX-1和COX-2。COX-2則主要與炎性反應(yīng)相關(guān)，主要在巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞內(nèi)表達，炎癥過程中釋放的細(xì)胞因子是COX-2的有效誘導(dǎo)劑。COX-2被大量誘導(dǎo)和表達，反過來又可引起炎癥的放達和增強。在本實驗中肝臟缺血再灌注時期的COX-2表達增強，肝組織病理損害以及肝功能損害明顯嚴(yán)重。通過應(yīng)用COX-2抑制劑（美洛昔康），肝組織內(nèi)COX-2表達明顯減弱，肝損傷較前明顯減輕，說明COX-2參與肝缺血再灌注損傷，其可能通過COX途徑抑制前列腺素產(chǎn)生，減少ROS生成，阻止白細(xì)胞遷徙及減少膜降解產(chǎn)物的生成有關(guān)。Ganey等和Mathurin等研究證實，COX-2表達下調(diào)可以減輕肝臟炎癥反應(yīng)；特異性的COX-2抑制荊能減輕肝臟缺血再灌注損傷[4,5]。Ito等[6]發(fā)現(xiàn)在阻斷大鼠肝動脈和門靜脈致部分肝臟缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，COX-1抑制劑和COX-2抑制劑能相對減少TNF-a和TXs的產(chǎn)生，從而起到降低肝臟的炎性反應(yīng)程度和改善肝血竇微循環(huán)的作用。

本研究在建立大鼠肝臟熱缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)上，觀察肝組織中COX-2表達與再灌注損傷之間的關(guān)系，以及其抑制劑美洛昔康對缺血再灌注損傷的影響。發(fā)現(xiàn)缺血再灌注6h后，A組大鼠血清中的ALT，AST和肝組織中的MDA、SOD活性分別顯著低于B組大鼠血清中的ALT，AST和肝組織中的MDA、SOD活性；B組大鼠肝組織發(fā)生了顯著的病理改變，而A組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)接近正常組織，病理改變不明顯。表明，COX-2抑制劑美洛昔康對缺血再灌注造成的肝功能下降有顯著的緩解作用，對肝組織損傷有明確的保護作用。

本實驗提示，COX-2抑制劑美洛昔康可以顯著降低肝臟中COX-2的活性，減輕肝缺血再灌注損傷，緩解移植肝功能下降，是預(yù)防和減輕肝缺血再灌注損傷的有效方法之一，同時也為肝缺血再灌注損傷的保護方法提供了理論依據(jù)。

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